一种检测毛霉菌的多重液滴数字PCR试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测毛霉菌的多重液滴数字PCR试剂盒。所述试剂盒包括盒体和盒盖；所述盒体内设有用于检测毛霉菌的液滴数字PCR反应液和质控品；所述液滴数字PCR反应液中含有用于检测米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉的特异性正反向引物和探针；所述探针两端标记有荧光基团。此外，所述试剂盒不仅在容纳腔顶端设置有容纳腔盖，所述容纳腔盖通过锁扣与锁栓的配套使用可防止试剂管在容纳腔内随意移动，保证运输安全，而且其对毛霉菌的检测特异性高，检测的假阴性率和假阳性率低，有效提高了毛霉菌检测灵敏度。菌检测灵敏度。菌检测灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
一种检测毛霉菌的多重液滴数字PCR试剂盒


[0001]本专利技术涉及病原微生物检测领域，具体地说，涉及一种检测毛霉菌的多重液滴数字PCR试剂盒。

技术介绍

[0002]毛霉菌又名黑霉或长毛霉，为腐生性真菌，具有蛋白质分解能力，常引起食物霉变。其普遍发现于土壤、粪便、禾草及空气等环境中，以孢囊孢子和接合孢子等形式繁殖，是一种条件致病性真菌，在人体免疫力低下时可能会引起人体致毛霉菌病 。一般来说，毛霉菌病症状首先发生在鼻和耳部，随着毛霉菌通过鼻腔和呼吸道进入患者体内，会引起颌窦和眼眶的坏死性炎症和肉芽肿；一旦毛霉菌经血流侵人脑部，引起脑膜炎；与此同时，毛霉菌还可能扩散至肺、胃肠道等。但是，由于毛霉病发病急，病情进展快，诊断困难，所以死亡率高。
[0003]目前，毛霉菌病的一般临床检测方法有痰培养、病理活检、影像学检测。但是，由于检出率和特异性均不高，极易误诊为其他病原体导致的感染，因此不足以在毛霉菌病及时精确诊断、毛霉菌病暴发和感染溯源等辅助诊断方面做出快速反应。鉴于这些因素，迫切需要开发辅助毛霉菌病快速诊断的产品。
[0004]因为具有操作简便、快速、灵敏度高和特异性强等优点，所以PCR检测技术的产品在微生物检测方面应用较为普遍。但是，传统PCR技术是一个基于终点的检测，只能进行定性或半定量的分析；而，实时荧光定量PCR需要标准曲线来进行定量分析。以上这些在一定程度上限制了基于PCR检测技术的产品在毛霉菌病及时精确诊断、毛霉菌病暴发和感染溯源等方面的应用。而，数字PCR是通过根据荧光信号的有无来进行绝对定量的第三代PCR技术，具有反应体系中抑制剂影响小，背景序列浓度干扰低和无需制作标准曲线的优点。因此，基于数字PCR技术的产品有望促进，拓展和改善PCR检测技术在毛霉菌病及时精确诊断、毛霉菌病暴发和感染溯源等辅助诊断方面的应用。
[0005]基于此，为了辅助毛霉菌病的及时精确诊断，保障毛霉菌病暴发和感染溯源工作的顺利开展，本专利技术申请人公开了一种毛霉菌的多重液滴数字PCR试剂盒。

技术实现思路

[0006]本专利技术要解决的技术问题在于克服毛霉菌病现有辅助诊断技术的不足，提供一种可以克服上述问题或者部分地解决上述问题的一种检测毛霉菌的多重液滴数字PCR试剂盒，为毛霉菌病的及时精确诊断，保障毛霉菌病暴发和感染溯源工作的顺利开展提供有力保障。
[0007]为了达到上述目的，本专利技术的技术方案是：一种检测毛霉菌的多重液滴数字PCR试剂盒，包括盒体和盒盖，盒体内设有用于检测毛霉菌的液滴数字PCR反应液和质控品，所述液滴数字PCR反应液中含有用于检测毛霉菌的特异性正反向引物和探针，所述探针两端标记有荧光基团。
[0008]进一步地，用于检测毛霉菌的特异性正反向引物和探针和探针序列包括：1）针对米根霉核酸序列设计的正向引物序列如SEQ ID 1所示，反向引物序列如SEQ ID 2所示，所述探针序列如SEQ ID 3所示；正向引物：5
´‑
TCAGTGACGCGATTTTAGAGATG
‑3´ꢀ
SEQ ID 1,反向引物：5
´‑
GAATGACCTATGACGCTATATAG
‑3´ꢀ
SEQ ID 2,检测探针：5
´‑
TAACAACAGCGTCCGCTACTGCA
‑3´ꢀ
SEQ ID 3；2）针对微小根毛霉核酸序列设计的正向引物序列如SEQ ID 4所示，反向引物序列如SEQ ID 5所示，所述探针序列如SEQ ID 6所示：正向引物：5
´‑
TGTAAGACCGCAGACGCGTCC
‑3´ꢀ
SEQ ID 4,反向引物：5
´‑
GAGTGACGCGATTTAGAGAAG
‑3´ꢀ
SEQ ID 5,检测探针：5
´‑
TGGACCGTCCACATTACCGTA
‑3´ꢀ
SEQ ID 6；3）针对伞枝横梗霉核酸序列设计的正向引物序列如SEQ ID 7所示，反向引物序列如SEQ ID 8所示，所述探针序列如SEQ ID 9所示：正向引物：5
´‑
GGTTTATACACGCCCTGTCCA
‑3´
SEQ ID 7,反向引物：5
´‑
CCAGTCTTGTGGGCCAGTGGAT
‑3´
SEQ ID 8,检测探针：5
´‑
GCAGTCTTGTAACCAGTGAGC
‑3´
SEQ ID 9；进一步地，所述探针序列的5
’
端标记有荧光报告基团，3
’
标记有荧光淬灭基团，所述荧光报告基团光谱范围不同。
[0009]优选地，所述SEQ ID 3所示核苷酸序列的5
’
端标记有Cy5，3
’
标记有BHQ2；所述SEQ ID 6所示核苷酸序列的5
’
端标记有FAM，3
’
标记有BHQ1；所述SEQ ID 9所示核苷酸序列的5
’
端标记有HEX，3
’
标记有Eclipse。
[0010]优选地，所述液滴数字PCR反应液中包括5
×
PerfeCTaMultiPlexq PCR ToughMix、1微摩尔每升Fluorescein sodium salt、所述6种25微摩尔每升正反向引物、所述3种25微摩尔每升探针。
[0011]优选地，质控品包括阴性质控品和阳性质控品，所述阴性质控品为无菌水，阳性质控品为米根霉DNA溶液, 微小根毛霉DNA溶液和伞枝横梗霉的DNA溶液。
[0012]进一步地，所述试剂盒还包括盒盖，所述盒盖与盒体铰连连接。
[0013]进一步地，所述盒体内设有若干个圆桶状容纳腔，所述容纳腔设置为能容纳装有液滴数字PCR反应液，包括用于检测毛霉菌的特异性正反向引物，探针，阴性质控品(灭菌无核酸酶水)，阳性质控品（米根霉DNA溶液, 微小根毛霉DNA溶液和伞枝横梗霉的DNA溶液）的试剂管。
[0014]进一步地，所述容纳腔的内径与所述试剂管的外径一致；所述容纳腔的壁厚为1
‑
2cm。
[0015]进一步地，所述容纳腔包括容纳腔盖，所述容纳腔盖与所述容纳腔腔口左边外壁和左边内壁的中间通过铰连结构固定连接，所述容纳腔盖上设置有锁扣，所述锁扣与所述容纳腔腔口右边外壁和右边内壁的中间设置的锁栓以卡扣结构形式配套使用。
[0016]一种利用所述多重液滴数字PCR试剂盒检测毛霉菌的方法，该方法包括以下步骤：第一步，对样品进行处理并提取DNA，得到样品处理液；第二步，打开所述试剂盒的盒盖和容纳腔盖，取出装有所述液滴数字PCR反应溶液的试剂管，配制液滴数字PCR反应溶液，将其与
第一步中所获得的样品处理液进行混合，获得液滴数字PCR反应混合液；第三步，将第二步中所获得的液滴数字PCR反应本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测毛霉菌的多重液滴数字PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括盒体和盒盖；所述盒体内设有用于检测毛霉菌的液滴数字PCR反应液和质控品；所述液滴数字PCR反应液中含有用于检测米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉的特异性正反向引物和探针；所述探针两端标记有荧光基团。2.根据权利要求1所述的一种检测毛霉菌的多重液滴数字PCR试剂盒，其特征在于，所述盒盖与盒体铰连连接。3.根据权利要求1所述的一种检测毛霉菌的多重液滴数字PCR试剂盒，其特征在于，所述盒体内设有圆桶状容纳腔；所述容纳腔设置为能容纳装有液滴数字PCR反应液，包括用于检测米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉的特异性正反向引物，探针，阴性质控品(灭菌无核酸酶水)，阳性质控品（米根霉DNA溶液, 微小根毛霉DNA溶液和伞枝横梗霉的DNA溶液）的试剂管。4.根据权利要求1所述的一种检测毛霉菌的多重液滴数字PCR试剂盒，其特征在于，所述检测米根霉的正向引物序列如SEQ ID 1所示，反向引物序列如SEQ ID 2所示，所述探针序列如SEQ ID 3所示：正向引物：5
´‑
TCAGTGACGCGATTTTAGAGATG
‑3´ꢀ
SEQ ID 1,反向引物：5
´‑
GAATGACCTATGACGCTATATAG
‑3´ꢀ
SEQ ID 2,检测探针：5
´‑
TAACAACAGCGTCCGCTACTGCA
‑3´ꢀ
SEQ ID 3；所述SEQ ID 3所示核苷酸序列的5
’
端标记的荧光基团为荧光报告基团Cy5，3
’
标记的荧光基团为荧光淬灭基团BHQ2。5.根据权利要求1所述的一种检测毛霉菌的多重液滴数字PCR试剂盒，其特征在于，所述检测微小根毛霉的正向引物序列如SEQ ID 4所示，反向引物序列如SEQ ID 5所示，所述探针序列如SEQ ID 6所示：正向引物：5
´‑
TGTAAGACCGCAGACGCGTCC
‑3´ꢀ
SEQ ID 4,反向引物：5
´‑
GAGTGACGCGATTTAGAGAAG
‑3´ꢀ
SEQ ID 5,检测探针：5
´‑
TGGACCGTCCACATTACCGTA
‑3´ꢀ

【专利技术属性】
技术研发人员：童云广，向红菊，
申请(专利权)人：杭州奥明医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：