莱氏绿僵菌LAMP检测引物组合物及可视化检测方法技术

本发明专利技术公开了一种莱氏绿僵菌LAMP检测引物组合物及可视化检测方法。其中LAMP检测引物组合物由正向内引物MrFIP、反向内引物MrFIP、正向外引物MrF3、反向外引物MrB3、正向环引物MrLoopF以及反向环引物MrLoopB组成；利用上述引物对莱氏绿僵菌进行扩增，检测结束后即可通过观察反应液的颜色对结果进行判定。本发明专利技术根据莱氏绿僵菌的β

【技术实现步骤摘要】
莱氏绿僵菌LAMP检测引物组合物及可视化检测方法


[0001]本专利技术属于病原真菌的分子生物学检测
，具体涉及莱氏绿僵菌LAMP检测引物组合物及可视化检测方法。

技术介绍

[0002]莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)，又称为莱氏蛾霉，是一种典型的双性型昆虫病原真菌，主要侵染以夜蛾科Noctuoidea为主的60多种鳞翅目Lepidoptera农业害虫幼虫，包括重要农林城市害虫棉铃虫、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、草地贪夜蛾、淡剑灰翅夜蛾等。该菌在自然条件下侵染死亡率高，条件适宜时可引起田间流行病，可有效控制害虫在经济损害阈值以下，因此莱氏绿僵菌的研究开发越来越受重视。目前已经分离得到了对草地贪夜蛾、淡剑灰翅夜蛾、斜纹夜蛾等具有致病性的莱氏绿僵菌菌株，但不同寄主及区域来源菌株的致病性常有较大差异。为了进一步开发莱氏绿僵菌对农业害虫的生防潜力，筛选和评估适宜的生物农药生产菌株，有必要进一步开发快速便捷的莱氏绿僵菌检测和监测技术。
[0003]目前，常用的菌株鉴定检测方法为形态鉴定和分子生物学鉴定(PCR)，其中传统形态鉴定需要耗费大量的时间和精力，灵敏度低，容易受到人为或环境等因素的干扰，且鉴定局限于纯菌株的的分离获得。而分子生物学的鉴定检测已开发出了常规PCR、巢式PCR以及实时荧光定量PCR法等不同方法技术，这类方法虽然较传统形态学显著缩短了鉴定时间，提高了准确度和灵敏性，但是其依赖于精密、价值较高的PCR，甚至昂贵的定量PCR仪才能进行；且鉴定/检测过程较为复杂，传统PCR还需要凝胶电泳等后续处理。如中国专利CN105349692A公开了一种检测Lactobacillusparacasei N1115菌株的引物对方法，中国专利CN114350750A公开了一种样品菌株鉴定方法，这些检测仪鉴定方法均需要多种程序才能确定结果。
[0004]环介导等温扩增技术(Loop
‑
mediated Isothermal Amplification，LAMP)能在等温条件下，短时间内进行核酸扩增，同时其依赖于识别保守序列DNA的6个特异性片段的多条引物和一种链置换DNA聚合酶即可一步完成扩增与检测，特异性较高、所需时间短，是一种简单快捷、精准的基因扩增方法。该方法不依赖高精仪器设备，依靠颜色变化可肉眼直接判断结果，目前已经被用来检测青枯菌(CN106893764A)、梨孢镰刀菌(CN106893763A)、小麦白粉菌(CN108103153B)等多种微生物，但是目前尚未有针对莱氏绿僵菌的LAMP检测引物及检测方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供莱氏绿僵菌LAMP检测引物组合物及可视化检测方法，其引物组合物的特异性高，利用引物组合物可以高灵敏度的检测到莱氏绿僵菌，且检测结果可视化。
[0006]本专利技术采用的技术方案如下：
[0007]本专利技术提供一种莱氏绿僵菌的LAMP检测引物组合物，由正向内引物MrFIP，反向内
引物MrFIP，正向外引物MrF3，反向外引物MrB3，正向环引物MrLoopF以及反向环引物MrLoopB组成，各引物序列如下：
[0008]MrF3：SEQ ID No.1；
[0009]MrB3：SEQ ID No.2；
[0010]MrFIP：SEQ ID No.3；
[0011]MrBIP：SEQ ID No.4；
[0012]MrLoopF：SEQ ID No.5；
[0013]MrLoopB：SEQ ID No.6。
[0014]优选的，3对检测引物组合物根据莱氏绿僵菌的特异性基因β
‑
tubin的序列设计。
[0015]优选的，检测引物组合物中各引物对的摩尔比为(MrFIP和MrBIP)：(MrF3和MrB3)：(MrLoopF和MrLoopB)＝8:1:2。
[0016]本专利技术还提供一种莱氏绿僵菌的可视化检测方法，具体包括以下步骤：
[0017](1)样品准备：提取待测样品的基因组DNA；
[0018](2)LAMP扩增：利用上述引物组合物或试剂盒进行检测，扩增温度为63
‑
65℃，扩增时间为30
‑
40min；
[0019](3)结果判读：反应结束后取出PCR反应管，观察反应管颜色，黄色表明样品中存在莱氏绿僵菌，红色则表明样品中不存在莱氏绿僵菌。
[0020]优选的，步骤(1)中的待测样品为纯化菌株的基因组DNA或土壤样品总DNA。
[0021]优选的，待测样品的浓度为100fg/μL以上。
[0022]有益效果
[0023](1)检测结果可视化，肉眼判读结果：本专利技术通过利用WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix试剂，将LAMP反应结束后结果利用颜色反应出来，通过肉眼观察结果可直接判断样品中是否含有莱氏绿僵菌。
[0024](2)特异性高：本专利技术通过对莱氏绿僵菌的保守基因β
‑
tublin的6个特异性区域设计了6对引物从而保证了LAMP扩增的高度特异性，即LAMP检测方法能从差异极小的基因样本中找到相应的靶序列进行扩增。
[0025](3)灵敏性高：本专利技术可以检测的目标DNA浓度范围为100fg/μL以上，是普通PCR的100倍。
[0026](4)本LAMP检测反应可以在30
‑
40min内完成，快速高效，同时LAMP不需要依赖于高精度、高价值的PCR仪器，一台控温准确的恒温水浴锅即可以进行实验，大大降低了实验成本。并且本专利技术制备的LAMP检测引物组合物以及可视化检测方法可以对土壤样本总DNA中是否含有莱氏绿僵菌进行检测，大大缩短的了传统分离筛选检测时间，避免了不必要的浪费，扩大了应用范围。
附图说明
[0027]图1为实施例2中采用不同方法提取的基因组DNA的LAMP检测结果图，图中1为CTAB法，2为Omega真菌DNA提取试剂盒法，3为Omega土壤DNA提取试剂盒法，4为通用基因组DNA提取试剂盒法，5为阴性对照。
[0028]图2为实施例3中不同温度条件下的LAMP检测结果图，其中1为60℃，2为63℃，3为
65℃，4为68℃，5为65℃时的阴性对照。
[0029]图3为实施例3中不同反应时间下的LAMP检测结果图，图中1为反应30min的阳性对照，2为反应30min的阴性对照，3为反应40min的阴性对照，4为反应50min的阴性对照。
[0030]图4为实施例4中不同模板浓度下的LAMP检测结果图，图1为10pg/μL，图2为1pg/μL，图3为100fg/μL，图4为10fg/μL，图5为1fg/μL，图6为阴性对照。
[0031]图5为实施例5中检测结果图，图中1为莱氏绿僵菌，2为莱氏绿僵菌(土壤样品)，3为平沙绿僵菌，4为金龟子绿僵菌，5为球孢白僵菌，6为胶孢炭疽菌，7为链格本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种莱氏绿僵菌的LAMP检测引物组合物，其特征在于：由正向内引物MrFIP，反向内引物MrFIP，正向外引物MrF3，反向外引物MrB3，正向环引物MrLoopF以及反向环引物MrLoopB组成，各引物序列如下：MrF3：SEQ ID No.1；MrB3：SEQ ID No.2；MrFIP：SEQ ID No.3；MrBIP：SEQ ID No.4；MrLoopF：SEQ ID No.5；MrLoopB：SEQ ID No.6。2.根据权利要求1所述的一种莱氏绿僵菌的LAMP检测引物组合物，其特征在于：所述检测引物组合物根据莱氏绿僵菌的特异性基因β
‑
tubin的序列设计。3.根据权利要求1所述的一种莱氏绿僵菌的LAMP检测引物组合物，其特征在于：所述检测引物组合物中各引物对的摩尔比为（MrFIP和MrBIP）：（MrF3和MrB3）：（MrLoopF和MrLoopB）=...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗卿权，孙荣华，路广亮，高磊，王凤，孙雪婷，李跃忠，
申请(专利权)人：上海市园林科学规划研究院，
类型：发明
国别省市：