一种芝麻蒴腐病病原菌的鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种芝麻蒴腐病病原菌的鉴定方法，属于芝麻生产研究技术领域，其技术要点是：包括鉴定方法步骤如下：步骤1：采集感病蒴果材料与菌株获取方法，采集芝麻感病蒴果，通过组织分离法获得病原菌菌株，对病原菌进行了形态鉴定；步骤2：鉴定结果与结果分析，经柯赫氏法则对病菌的致病性进行验证，分析病菌的rDNA

【技术实现步骤摘要】
一种芝麻蒴腐病病原菌的鉴定方法


[0001]本专利技术涉及芝麻生产研究
，具体是涉及一种芝麻蒴腐病病原菌的鉴定方法。

技术介绍

[0002]芝麻，隶属于胡麻科胡麻属，是世界上最古老的油料作物之一，也是我国四大油料作物之一，用途广泛。芝麻在全世界有60多个国家种植，主要分布在亚洲和非洲，中国是继印度、苏丹、缅甸之后的第四大芝麻生产国，平均单产达到1400.7kg/hm2，居四大主产国之首。近几年，芝麻产区病害的发生导致我国芝麻产量不稳，年度间产量差异较大，进而影响到我国芝麻产业的稳定和正常发展。
[0003]芝麻蒴腐病是芝麻生产上的重要病害之一，近几年，芝麻蒴腐病在我国芝麻产区均有不同程度发生，尤其是河南、辽宁、吉林、内蒙古等省区发生严重。蒴腐病一般在7月份芝麻进入盛花期开始发病，8月上中旬达到发病高峰，发病严重时造成蒴果被深褐色或黑色病斑包裹，感病蒴果果皮薄而小、变形、坏死、变硬，顶部偶有裂口，导致种子不成熟、籽粒瘦瘪，降低芝麻产量和品质。现阶段国内外还未见有关芝麻蒴腐病的研究报道，对致病菌、发病规律还不清楚，这对病害的预测预报和防治工作造成障碍。因此，明确引起芝麻蒴腐病的病原菌及其生物学特性，对于该病的防治具有重要意义。

技术实现思路

[0004]针对现有技术存在的不足，本专利技术实施例的目的在于提供一种芝麻蒴腐病病原菌的鉴定方法，以解决上述
技术介绍
中的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0006]一种芝麻蒴腐病病原菌的鉴定方法，鉴定方法步骤如下：
[0007]步骤1：采集感病蒴果材料与菌株获取方法，采集芝麻感病蒴果，通过组织分离法获得病原菌菌株，对病原菌进行了形态鉴定；
[0008]步骤2：鉴定结果与结果分析，经柯赫氏法则对病菌的致病性进行验证，分析病菌的rDNA
‑
ITS和EF
‑
1α基因序列特征；
[0009]步骤3：得出结论并进行讨论，A.alternata的培养基为V8和PDA培养基；链格孢菌菌丝生长适宜温度为25～30℃，温度为28℃；适宜菌丝生长的pH值在5～8之间，碳源为葡萄糖，氮源为蛋白胨。
[0010]作为本专利技术进一步的方案，所述步骤1包括如下步骤：
[0011]步骤11：芝麻蒴腐病病原菌鉴定；
[0012]步骤12：芝麻蒴腐病病原菌生物学特性研究，将ZMHJ
‑
12病原菌活化后于菌落边缘取直径5mm菌饼，接种到培养基平板中央，每皿1片，每处理重复4皿，28℃恒温培养箱中培养7d，采用十字交叉法测量菌落直径，并观察菌落的形态特征；
[0013]步骤13：数据分析，利用DPS软件对试验数据进行单因子方差分析，采用Duncan氏
新复极差法进行差异显著性检测。
[0014]作为本专利技术进一步的方案，所述步骤11包括以下步骤：
[0015]步骤111：田间症状调查及病样采集，田间记录发病症状，将样本带回实验室进一步分离以及鉴定；
[0016]步骤112：病原菌分离纯化，采用组织分离法对病原菌进行分离以及纯化，取病健交界处组织，切取1
‑
2cm正方小块，2％次氯酸钠表面消毒2min，用无菌水清洗3次，置于PDA培养基上，25℃培养。待病菌分生孢子产生后，在高倍体视镜下从PDA培养基上用接种针挑取单孢，获得纯化菌株，编号为ZMHJ
‑
12；
[0017]步骤113：病原菌形态学鉴，将纯化的菌株接种于PDA培养基上25℃培养，观察记录菌落的颜色、形态、表面特征、生长速度以及边缘生长状况，在电子显微镜下观察孢子的类型、着生方式、大小、颜色以及分生孢子梗的特征；
[0018]步骤114：病原菌致病力测定，采用柯赫氏法则对分离所得病原物进行回接验证，将分离的病菌转接到PDA培养基上，置于25℃恒温培养箱培养5～7d，直至菌丝长满培养皿并产生大量孢子时，在培养皿中加入少量无菌水，用牙刷将培养皿上的菌丝体洗下，收集到消毒烧杯中，经2层纱布过滤后，用红细胞计数法将病菌孢子悬液浓度调节为2.5
×
105个/mL，并加入0.1％的吐温
‑
20，备用；
[0019]步骤115：病原菌分子生物学鉴定，选取15个代表性菌株进行病原菌鉴定，将菌株于PDA培养基培养，离心后用滤纸过滤回收菌丝体。用Gentra公司的puregene DNA提取试剂盒提取DNA，选择真菌rDNA ITS区域通用引物ITS1(5
’‑
TCCGTAGGTGAACCTGCGG
‑3’
)和ITS4(5
’‑
TCCTCCGCTTATTGATATGC
‑3’
)、EF
‑
1a基因序列特异性引物EF
‑
1aF(5
’‑
CATCGAGAAGTTCGAGAAGG
‑3’
)、EF
‑
1aR(5
’‑
TACTTGAAGGAACCCTTACC
‑3’
)，进行ITS区域PCR扩增，测序结果经过GenBank数据库进行同源比对分析。
[0020]作为本专利技术进一步的方案，所述步骤114还包括采用室内盆栽试验对分离菌株进行致病力测定，供试菌株ZMHJ
‑
12。待盆栽芝麻植株生长至盛花期时，采用喷雾法，对植株进行喷雾直至径流，共接种10盆，每盆1株，接种后保湿，以喷施等量无菌水为对照。
[0021]作为本专利技术进一步的方案，所述步骤2包括如下步骤：
[0022]步骤21：芝麻蒴腐病病原的分离与鉴定；
[0023]步骤22：芝麻蒴腐病生物学特性研究；
[0024]步骤23：温度对菌丝生长的影响，芝麻蒴腐病病原菌ZMHJ12菌丝适宜生长范围在20～30℃；
[0025]步骤24：pH对菌丝生长的影响，在酸性的环境下，适合芝麻蒴腐病菌ZMHJ12生长；
[0026]步骤25：碳氮源对菌丝生长的影响，芝麻蒴腐病病原菌ZMHJ12菌丝生长氮源为葡萄糖，芝麻蒴腐病病原菌ZMHJ12氮源为蛋白胨；
[0027]步骤26：光照对菌丝生长的影响，研究不同光照条件下芝麻蒴腐病病原菌ZMHJ12的菌落差异。
[0028]作为本专利技术进一步的方案，所述步骤21包括以下步骤：
[0029]步骤211：田间症状调查；
[0030]步骤212：致病性测定，蒴果表面出现褐色或深褐色斑点，随着病变的发展，病斑面积逐渐增大，25d整个果实呈深褐色或黑色，病果果皮薄而小、变形、坏死以及变硬，顶部有
裂口；
[0031]步骤213：病原菌形态特征，病原菌在PDA平板上培养，菌落初为白色，质地致密，之后菌落中心颜色逐渐加深呈橄榄色，菌落背面外缘白色，中间为黑褐色至黑色，菌丝白色丰富，分生孢子梗多分枝，棕色至黑色，菌丝有间隔；
[0032]步骤21本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种芝麻蒴腐病病原菌的鉴定方法，其特征在于，鉴定方法步骤如下：步骤1：采集感病蒴果材料与菌株获取方法，采集芝麻感病蒴果，通过组织分离法获得病原菌菌株，对病原菌进行了形态鉴定；步骤2：鉴定结果与结果分析，经柯赫氏法则对病菌的致病性进行验证，分析病菌的rDNA
‑
ITS和EF
‑
1α基因序列特征；步骤3：得出结论并进行讨论，A.alternata的培养基为V8和PDA培养基；链格孢菌菌丝生长适宜温度为25～30℃，温度为28℃；适宜菌丝生长的pH值在5～8之间，碳源为葡萄糖，氮源为蛋白胨。2.根据权利要求1所述的芝麻蒴腐病病原菌的鉴定方法，其特征在于，所述步骤1包括如下步骤：步骤11：芝麻蒴腐病病原菌鉴定；步骤12：芝麻蒴腐病病原菌生物学特性研究，将ZMHJ
‑
12病原菌活化后于菌落边缘取直径5mm菌饼，接种到培养基平板中央，每皿1片，每处理重复4皿，28℃恒温培养箱中培养7d，采用十字交叉法测量菌落直径，并观察菌落的形态特征；步骤13：数据分析，利用DPS软件对试验数据进行单因子方差分析，采用Duncan氏新复极差法进行差异显著性检测。3.根据权利要求2所述的芝麻蒴腐病病原菌的鉴定方法，其特征在于，所述步骤11包括以下步骤：步骤111：田间症状调查及病样采集，田间记录发病症状，将样本带回实验室进一步分离以及鉴定；步骤112：病原菌分离纯化，采用组织分离法对病原菌进行分离以及纯化，取病健交界处组织，切取1
‑
2cm正方小块，2％次氯酸钠表面消毒2min，用无菌水清洗3次，置于PDA培养基上，25℃培养。待病菌分生孢子产生后，在高倍体视镜下从PDA培养基上用接种针挑取单孢，获得纯化菌株，编号为ZMHJ
‑
12；步骤113：病原菌形态学鉴，将纯化的菌株接种于PDA培养基上25℃培养，观察记录菌落的颜色、形态、表面特征、生长速度以及边缘生长状况，在电子显微镜下观察孢子的类型、着生方式、大小、颜色以及分生孢子梗的特征；步骤114：病原菌致病力测定，采用柯赫氏法则对分离所得病原物进行回接验证，将分离的病菌转接到PDA培养基上，置于25℃恒温培养箱培养5～7d，直至菌丝长满培养皿并产生大量孢子时，在培养皿中加入少量无菌水，用牙刷将培养皿上的菌丝体洗下，收集到消毒烧杯中，经2层纱布过滤后，用红细胞计数法将病菌孢子悬液浓度调节为2.5
×
105个/mL，并加入0.1％的吐温
‑
20，备用；步骤115：病原菌分子生物学鉴定，选取15个代表性菌株进行病原菌鉴定，将菌株于PDA培养基培养，离心后用滤纸过滤回收菌丝体。用Gentra公司的puregene DNA提取试剂盒提取DNA，选择真菌rDNA ITS区域通用引物ITS1(5
’‑
TCCGTAGGTGAACCTGCGG
‑3’
)和ITS4(5<...

【专利技术属性】
技术研发人员：高德学，安启源，那艳斌，孙会杰，程洪森，窦淑华，王正军，荣久艳，田静，
申请(专利权)人：辽宁省经济作物研究所，
类型：发明
国别省市：