基于RPA-PfAgo技术检测虾肝肠孢虫的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于RPA

【技术实现步骤摘要】
基于RPA
‑
PfAgo技术检测虾肝肠孢虫的方法


[0001]本专利技术属于水生生物病原检测
，具体涉及基于RPA
‑
PfAgo技术检测虾肝肠孢虫的方法。

技术介绍

[0002]虾肝肠孢虫(Enterocytozoonhepatopenaei,EHP)是一类专性细胞内寄生的微孢子虫，主要感染养殖对虾的肠道表皮及肝胰腺，寄生于肝胰腺小管上皮细胞。其感染致使对虾消化吸收功能下降，影响了营养物质的吸收，感染早期无明显症状和死亡，较难发现，通常在养殖30～45d后可见养殖对虾呈现生长缓慢，大小不一等现象。且对虾个体生长速率与体内EHP的载量指数呈显著的负相关。此外，EHP感染还会增加南美白对虾对急性肝胰腺坏死(acute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND)和感染性肝胰腺坏死(septic hepatopancreatic necrosis，SHPN)病原的易感性，从而增加AHPND和SHPN的发病几率。因此EHP感染极大的危害了对虾养殖产业的健康发展。
[0003]定期监测和早期检测是预防虾肝肠孢虫感染的重要手段。随着现代分子生物学技术的发展，已经开发了许多检测虾肝肠孢虫的方法，包括巢式PCR、荧光定量PCR技术、环介导等温扩增法和重组酶聚合酶扩增等技术。目前以其孢壁蛋白SWP序列为靶基因进行的检测，具有较高的特异性。目前已建立以SWP为靶基因的nested
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PCR检测技术，但该技术只能用于定性检测，且操作繁琐，需要多对引物进行多次扩增反应，耗时较长，灵敏度低和假阳性率高，依赖热循环仪器。近年来，各种核酸酶层出不穷，由于多数核酸酶具有可编程性且容易表达，因此被广泛用于分子检测。PfAgo是一种核酸引导的核酸内切酶，可被特定序列的核酸激发切割活性，通过检测探针的荧光信号从而实现核酸检测，并且，目前还没有将PfAgo核酸酶应用于水产养殖传染病检测的相关报道。另外，现有的虾肝肠孢虫检测方法灵敏度不足，且对样本要求较高。因此需建立一种以SWP为靶基因的高灵敏度、特异性强的虾肝肠孢虫检测方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术基于RPA
‑
PfAgo技术，可对水产养殖中虾肝肠孢虫的检测提供一种新的快速、高效、特异性的分子诊断方法。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案包括：
[0006]本专利技术的第一方面，提供一种引物组，包括对靶基因SWP进行RPA扩增的引物对，以及PfAgo反应的向导DNA和分子信标，序列如下：
[0007]RPA
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F：CAGCTTAAAGAAGTTTGCAATG；
[0008]RPA
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R：CATTTTCCTTTTATCTTCTGATATGC；
[0009]向导DNA:PHO
‑
CTTCTGATATGCATTC；
[0010]分子信标：FAM
‑
ggtgcgTTTTATCTTCTGATATcgcacc
‑
BHQ1。
[0011]本专利技术的第二方面，提供所述引物组的用途，包括：鉴定或辅助鉴定虾肝肠孢虫；
鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有虾肝肠孢虫。
[0012]本专利技术的第三方面，提供一种试剂盒，包括上述引物组、RPA核酸扩增冻干酶和PfAgo酶。
[0013]本专利技术的第四方面，提供所述试剂盒中的用途，包括：鉴定或辅助鉴定虾肝肠孢虫；鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有虾肝肠孢虫。
[0014]本专利技术的第五方面，提供一种鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有虾肝肠孢虫的方法，包括以下步骤：
[0015](1)提取待测样本中的核酸，提取液作为RPA反应的模板；
[0016](2)采用RPA扩增引物对，对待测样品的核酸进行RPA扩增，扩增完后进行柱色谱纯化得到柱纯化RPA扩增产物；
[0017](3)将本专利技术提供的所述向导DNA、分子信标和PfAgo酶与所述步骤(2)得到的柱纯化RPA扩增产物混合，进行PfAgo酶切反应；
[0018](4)检测上述反应体系中所述分子信标切割后产生的荧光情况，若荧光值与阴性对照相比有显著差异，则判断RPA产物中含有虾肝肠孢虫的特异性扩增产物，从而推断样品中含有虾肝肠孢虫；若荧光值与阴性对照相比没有显著差异，则判断RPA产物中不含有虾肝肠孢虫的特异性扩增产物，从而推断样品中不含有虾肝肠孢虫。
[0019]优选地，步骤(2)中RPA反应体系包括以下组分：5μL的模板，浓度为10μM的RPA
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F、RPA
‑
R引物各2μL。
[0020]优选地，步骤(2)中RPA反应条件为：通过添加2.5μL乙酸镁(280mM)启动反应，并在37℃孵育30min。
[0021]优选地，步骤(3)中PfAgo反应体系包括以下组分：3μL柱纯化RPA扩增产物作为模板，10μM的PfAgo蛋白2μL,2μL浓度为20μM向导DNA，2μL浓度为10μM分子信标，10
×
reaction Buffer 2μL，超纯水9μL。
[0022]优选地，步骤(3)中PfAgo反应条件为：混匀离心后放入荧光定量PCR仪中，在95℃下充分反应60分钟，每60秒记录一次FAM荧光信号。
[0023]本专利技术的具体原理是：利用RPA反应对样本核酸进行扩增，利用向导DNA和PfAgo蛋白对特定序列进行酶切，根据分子信标相对于对照组荧光强度的强弱进行判别是否含有目标序列。
[0024]本专利技术的有益效果：本研究建立了RPA
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PfAgo的检测方法，这是PfAgo在水产养殖传染病诊断中的首次应用。它具有良好的特异性，并达到1copies/μl的灵敏度，高于当前可用的分子检测方法。整个过程可以在1.5小时内完成，包括样品处理时间，并且只需要最少的实验室设备。可用于偏远地区的现场检测。
[0025]相关定义
[0026]RPA：重组酶聚合酶等温核酸扩增技术
附图说明
[0027]图1RPA
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PfAgo特异性与灵敏度检测(A)特异性检测(B)EHP质粒标准品的灵敏度(C)EHP样本DNA的灵敏度。
[0028]图2EHP临床样本的检测(A)用RPA
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PfAgo方法检测15个EHP临床样本(1
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15)(B)用
巢式PCR检测15个EHP临床样本(1
‑
15)
具体实施方案
[0029]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。
[0030]样本来源
[0031]临床样本基因组DNA以及细菌菌株，由江苏海洋与海洋渔业研究所提供，
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80℃保存。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种引物组，包括对靶基因SWP进行RPA扩增的引物对，以及PfAgo反应的向导DNA和分子信标，序列如下：RPA
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F：CAGCTTAAAGAAGTTTGCAATG；RPA
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R：CATTTTCCTTTTATCTTCTGATATGC；向导DNA:PHO
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CTTCTGATATGCATTC；分子信标：FAM
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ggtgcgTTTTATCTTCTGATATcgcacc
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BHQ1。2.权利要求1所述引物组的用途，包括：鉴定或辅助鉴定虾肝肠孢虫；鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有虾肝肠孢虫。3.一种试剂盒，包括权利要求1所述的引物组、RPA核酸扩增冻干酶和PfAgo酶。4.权利要求3所述试剂盒中的用途，包括：鉴定或辅助鉴定虾肝肠孢虫；鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有虾肝肠孢虫。5.一种鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有虾肝肠孢虫的方法，包括以下步骤：(1)提取待测样本中的核酸，提取液作为RPA反应的模板；(2)采用权利要求3所述的RPA扩增引物对和RPA核酸扩增冻干酶，对待测样品的核酸进行RPA扩增，扩增完后进行柱色谱纯化得到柱纯化RPA扩增产物；(3)将权利要求3所述的向导DNA、分子信标和PfAgo酶与所述步骤(2)得到的柱纯化...

【专利技术属性】
技术研发人员：高嵩，杨丽红，王佩，赵陈洁，王昱，张雪，王月，唐怡鑫，
申请(专利权)人：江苏海洋大学，
类型：发明
国别省市：