一种用于制备人血浆来源的免疫球蛋白M(IgM)的组合物的方法，其包括以下步骤：(a)IgM的PEG沉淀；(b)经沉淀的IgM的重悬；(c)执行吸附层析法；(d)移除同种凝集素A/B；(e)纳滤；及(f)超滤/渗滤。在用于制备所述组合物的所述方法中，所述沉淀步骤a)优选地在4.5与6.5之间的pH执行，且PEG优选地处于5％(w/v)与11％(w/v)之间的浓度。之间的浓度。之间的浓度。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于获得包含人血浆来源的免疫球蛋白M的组合物的方法
[0001]背景
[0002]本公开内容涉及医药产品的领域。本文中的某些实施方式涉及用于获得包含免疫球蛋白M(IgM)的组合物的方法，该组合物可用于许多治疗适应症。
[0003]相关技术描述
[0004]因为正常人血浆含有大量的IgM，所以可能实际的及经济上可行的是经由产生治疗性制剂来利用这些IgM的治疗潜力。实际上，据报道，富含IgM的免疫球蛋白制剂Pentaglobin中占总免疫球蛋白含量的12％的为IgM，该制剂已成功地用于治疗患者的与败血症相关联的感染以及移植物排斥，及在实验模型中用于某些炎性状况。此类制剂亦可为抗击在患有自体免疫疾病的患者中出现的感染提供益处。
[0005]适于人类施用的血浆来源的多克隆IgM医药组合物可用于治疗全身性抗生素抗性细菌感染(菌血症)，此为尚未得到满足的临床需要的领域，尽管可考虑其他适应症。IgM在血浆中主要以其五聚物形式循环，该五聚物形式包含经由二硫键连接的5个相同IgM单体。
[0006]IgM医药组合物并不普遍，这很可能是归因于与适于治疗性用途的浓度的纯IgM溶液的生产相关的困难性。此外，其纯化因蛋白的大小(>IgG分子量的6倍)及其倾向于自我缔合成较高分子量的物质而复杂化，这样的较高分子量的物质可能为惰性的或潜在地为患者带来免疫性风险或其他风险。这些医药组合物的多克隆特性提出甚至更大的挑战，这是归因于缺乏抗体的均一性，其中不同水平的可溶性可与不同的IgM群体相关联。另外，因为IgM为与血型错配凝集/溶血最为相关的抗体，所以必须减少结合至红细胞(red blood cell；RBC)的表面上的血型A及B抗原的IgM的水平。
[0007]IgM医药组合物中期望的特性包括高纯度(IgM含量>97％)、高活性(如藉由对临床相关细菌抗原的特异性结合亲和力及对活化补体的能力两者所测量的)、减少的同种凝集素效价(titer)、非特异性地活化补体的最小能力、及<10％的聚集物质(本专利技术上下文中所定义，以包括大小大于五聚物的可逆及不可逆物质两者)。
[0008]鉴于上文，对提供获得克服该等缺点的人血浆来源的IgM的方法仍存在需要。本专利技术人已开发出获得IgM医药组合物的方法以克服典型地与此蛋白相关联的挑战。在该方法中，采取诸多步骤来最小化IgM聚集物的水平。这是藉由对IgM易于自我缔合的条件的理解来进行，其中许多条件在纯化过程期间遇到。这些条件包括高IgM浓度，暴露于接近其等电点的pH(针对多克隆人类IgM的5.5
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7.4的范围)，高/低离子强度及中性/酸性pH及机械应力的某些组合。另外，将稳定剂精氨酸添加至方法的某些步骤以抑制IgM自我缔合及可逆地解离自我缔合的聚集物。为解决同种凝集素效价的问题，此产品还包括了对结合至A/B RBC表面抗原的那些IgM为特异性的亲和层析法以增强安全性。
[0009]最终，方法允许安全、高纯度、高浓度的多克隆IgM产品。对比而言，号称为富IgM疗法的现在可商购的唯一产品Pentaglobin仅包含12％ IgM，而剩余88％为IgG及IgA。该产品具有已报道的约6g/L的IgM浓度。藉由本专利技术获得的组合物根据免疫散射比浊法所评估为
至少97％ IgM，具有<10％的聚集物含量及≥15g/L的IgM浓度，其中具有50g/L或更大的产品藉由所描述的方法为可行的。
[0010]本专利技术的方法包括从人血浆纯化及浓缩多克隆IgM的步骤。已作出努力来确保单元操作的逻辑流程，各步骤之间需要最少的人工介入(pH调整、浓缩/稀释、离子强度调整等等)。开发并实施专用于缓冲液交换、杂质减少、同种凝集素减少、病原体清除能力及制剂的单元操作。设计这些操作以使得IgM聚集物的形成最小化。该方法亦包括其中将存在的那些聚集物移除或转化回单五聚物的步骤。
[0011]附图简述
[0012]图1显示在PEG沉淀之前(ANX条带(strip))及之后(PEG悬浮液)的SEC
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HPLC谱的比较。注意，高MW IgM物质减少。亦观察到IgG及IgA的丰度的一些减少。层析图的区域藉由分子量的MALS分析估算来识别。五聚物为约930kDa，而双五聚物为约1.8MDa。较高的MW聚集物区域为相对多分散的，其中分子量大于双五聚物。
[0013]图2显示在渗滤之前pH对IgM的浓度的影响。a)显示浓缩前的SEC
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HPLC谱(2mg/mL)；且b)显示浓缩后的SEC
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HPLC谱(20mg/mL)。
[0014]图3显示UF/DF上样pH对配制成25mg/mL的IgM的配制后IgM五聚物含量的影响。
[0015]图4显示纯化IgM组合物的还原型SDS
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PAGE。将起始材料(ANX条带)与最终产品(经配制主体)相比较。图中指示出条带鉴定。
[0016]图5显示与从汇集的人血浆纯化IgM的方法有关的图表。
[0017]概述
[0018]在第一方面中，本专利技术涉及一种用于制备人血浆来源的免疫球蛋白M(IgM)的组合物的方法，其包含以下步骤：
[0019]a)使用聚乙二醇(PEG)对该IgM的沉淀；
[0020]b)经沉淀的IgM的重悬；
[0021]c)吸附层析法；
[0022]d)移除同种凝集素A/B；
[0023]e)纳滤；及
[0024]f)超滤/渗滤。
[0025]在一个实施方式中，该沉淀步骤a)在4.5与6.5之间的pH执行。
[0026]在一个实施方式中，该PEG处于5％(w/v)与11％(w/v)之间的浓度。优选地，该PEG为PEG
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3350。
[0027]在一个实施方式中，该吸附层析法为陶瓷羟磷灰石(CHT)层析法。
[0028]在一个实施方式中，陶瓷羟磷灰石CHT的上样溶液包含优选地处于0.5M与2.0M之间的浓度的NaCl。
[0029]在一个实施方式中，陶瓷羟磷灰石CHT的洗涤溶液包含优选地处于1M与4M之间的浓度的尿素。
[0030]在一个实施方式中，移除同种凝集素A/B的该步骤d)藉由使用A/B寡糖作为配体的亲和层析法来执行。
[0031]在一个实施方式中，移除同种凝集素A/B的该步骤d)使用至少两个串联的亲和柱来执行，至少一个亲和柱具有寡糖A作为配体，且至少一个亲和柱具有寡糖B作为配体，或步
骤d)使用含有具有寡糖A及寡糖B的混合物作为配体的至少一个亲和柱来执行。
[0032]在一个实施方式中，该纳滤步骤e)经由具有35nm或更大的平均孔径的过滤器来执行。
[0033]在一个实施方式中，该纳滤步骤e)使用pH在6.0与9.0之间的包含至少0.5M的精氨酸
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HCl的缓冲液来执行。优选地，该纳滤步骤e)系使用pH在7.0与8.0之间本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于制备人血浆来源的免疫球蛋白M(IgM)的组合物的方法，其包含以下步骤：步骤a)所述IgM的聚乙二醇(PEG)沉淀；步骤b)经沉淀的所述IgM的重悬；步骤c)执行吸附层析法；步骤d)移除同种凝集素A/B；步骤e)纳滤；及步骤f)超滤/渗滤。2.根据权利要求1所述的用于制备组合物的方法，其中所述步骤a)中的沉淀在4.5与6.5之间的pH执行。3.根据权利要求1或2所述的用于制备组合物的方法，其中所述PEG处于5％(w/v)与11％(w/v)之间的浓度。4.根据前述权利要求中任一项所述的用于制备组合物的方法，其中所述吸附层析法为陶瓷羟磷灰石(CHT)层析法。5.根据权利要求4所述的用于制备组合物的方法，其中所述陶瓷羟磷灰石(CHT)层析法的上样溶液包含0.5M至2.0M的NaCl。6.根据权利要求4或5所述的用于制备组合物的方法，其中所述陶瓷羟磷灰石(CHT)层析法的洗涤溶液包含处于1M与4M之间的浓度的尿素。7.根据前述权利要求中任一项所述的用于制备组合物的方法，其中所述步骤d)中的移除同种凝集素A/B藉由使用A/B寡糖作为配体的亲和层析法来执行。8.根据前述权利要求中任一项所述的用于制备组合物的方法，其中所述步骤d)中的移除同种凝集素A/B使用至少两个串联的亲和柱来执行，至少一个亲和柱具有寡糖A作为配体，且至少一个亲和柱具有寡糖B作为配体，或所述步骤d)使用含有具有寡糖A及寡糖B的混合物作为配体的至少一个亲和柱来执行。9.根据前述权利要求中任一项所述的用于制备组合物的方法，其中所述步骤e)中的纳滤经由具有35nm或更大的平均孔径的过滤器来执行。10.根据前述权利要求中任一项所述的用于制备组合物的方法，其中所述步骤e)中的纳滤使用pH在6.0与9.0之间的包含至少0.5M的精氨酸
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HCl的缓冲液来执行。11.根据前述权利要求中任一项所述的用于制备组合物的方法，其中所述初始超滤浓缩步骤在4.5与5.0之间的pH及在存在聚山梨醇酯80的情况下执行。12.根据前述权利要求中任一项所述的用于制备组合物的方法，其中所述步骤f)中的渗滤在约3.8与约4.8之间的pH用含有氨基酸的琥珀酸盐缓冲液来执行。13.根据权利要求12所述的用于制备组合物的方法，其中所述氨...
【专利技术属性】
技术研发人员：迈尔斯，
申请(专利权)人：基立福环球运营有限公司，
类型：发明
国别省市：
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