一种人GLI1蛋白Ser937位点磷酸化抗体的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种人GLI1蛋白Ser937位点磷酸化抗体的制备方法，包括如下步骤：(1)确定人GLI1Ser937蛋白磷酸化位点；(2)根据GLI1靶点序列及已知的磷酸化位点Ser937，设计需要合成的磷酸化及非磷酸化多肽序列；(3)合成氨基酸序列的抗原合成肽，将该多肽与载体蛋白偶联用作抗原；(4)将步骤(3)合成的抗原合成肽免疫动物并收集抗血清；(5)将步骤(4)收集的抗血清进行纯化和鉴定，得到人GLI1蛋白Ser937位点磷酸化抗体。本发明专利技术制备得到的高特异性的人GLI1蛋白Ser937位点磷酸化抗体可用Western blot实验检测正常细胞、肿瘤细胞的表达差异，有助于研究GLI1蛋白的磷酸化修饰在肿瘤疾病发生发展过程中的作用，为临床肿瘤疾病的诊断或治疗提供潜在的作用靶点。疗提供潜在的作用靶点。疗提供潜在的作用靶点。

【技术实现步骤摘要】
一种人GLI1蛋白Ser937位点磷酸化抗体的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及抗体
，具体为一种人GLI1蛋白Ser937位点磷酸化抗体的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]Hedgehog(HH)信号通路在哺乳动物器官发育、再生和体内平衡中具有重要意义，HH通路的失调被发现是先天性综合征的原因。在脊椎动物中，HH配体包括Sonic HH(SHH)、Indian HH(IHH)和Desert HH(DHH)，分别在不同的组织器官中差异表达。IHH参与软骨内骨化，DHH的作用局限于卵巢颗粒细胞和睾丸支持细胞等性腺，SHH在胚胎发育的各个阶段具有时空表达特性，保持着活跃的状态，但是在成年后的机体中，SHH通路的活性显著下降。SHH通路的异常表达会导致机体大脑，肺，肾上腺，肢体等器官和组织的发育异常及相关疾病发生。此外，SHH信号随后被证明可以在成年组织中调节干细胞的稳态，持续的SHH信号激活引发多种肿瘤发生，如皮肤基底细胞癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、结肠癌、食道癌、乳腺癌与肝癌等。研究HH信号的调控将不仅为组织器官的生理过程而且为其病理过程提供新的理论，具有重要的意义。
[0003]Hedgehog信号通路主要由分泌型糖蛋白配体Hedgehog、跨膜型蛋白受体Patched(PTCH)和跨膜G蛋白偶联型受体Smoothened(SMO)及转录因子GLI家族组成。PTCH是一种12次跨膜型蛋白，具有结合HH配体及抑制SMO受体的双重功能。在配体缺失情况下，PTCH与SMO结合并抑制其活性，关键转录因子GLI在蛋白酶体内被截断，并以羧基端被截断的形式进入细胞核内，抑制下游靶基因的转录。但当HH配体存在时，PTCH与HH配体结合，解除对SMO的抑制，SMO向初级纤毛顶端移位，进一步激活GLI转录因子家族，激活下游靶基因Cyclin D1、Myc、PTCH和GLI1等的转录，参与细胞的增殖及组织的分化。
[0004]脊椎动物中GLI转录因子包括GLI1、GLI2和GLI3，是HH信号激活或者失活下游靶基因的关键转录因子。当没有SHH刺激时，GLI2和GLI3通过PKA、GSK3β和CK1激酶磷酸化以及SCF/β
‑
TRCP泛素连接酶的有限降解，使得GLI2和GLI3被翻译后修饰成转录抑制形式而抑制SHH信号。当存在SHH刺激时，SMO通过Cos2/Kif7和SuFu两个抑制性调节分子结合，抑制PKA活性而增加GLI2和GLI3的转录激活形式激活SHH信号靶基因转录。GLI1既是HH通路的激活因子也是其靶基因，因此GLI1的表达水平可反映HH通路的活化程度。在GLI1翻译后修饰方面，AMPK激酶不仅减少GLI1的核定位且磷酸化S102
‑
、S408
‑
和T1074
‑
GLI1导致其β
‑
TrCP中介的泛素化降解而抑制HH信号。MEKK2和MEKK3通过磷酸化GLI1的S201、S204、S243、S968、T1074和S1078位点影响GLI1蛋白稳定性、与SuFu的结合能力以及与DNA的结合能力而抑制GLI1转录活性。MEKK1磷酸化GLI1多个位点而抑制HH信号活性和髓母细胞瘤增殖。Plk1激酶通过磷酸化GLI1的S481位点而增加GLI1核输出以及与SuFu的结合，而抑制HH信号。阐明GLI1翻译后修饰的调控机制有助于深入理解HH信号功能。
[0005]现有的GLI1磷酸化抗体虽然可以用于Westernblot实验检测正常细胞、肿瘤细胞的表达差异，但尚未有做免疫组化的，也无法为临床肿瘤疾病的诊断或治疗提供潜在的作
用靶点。

技术实现思路

[0006]针对上述存在的技术不足，本专利技术的目的是提供一种人GLI1蛋白Ser937位点磷酸化抗体的制备方法及其应用，以解决
技术介绍
中提出的问题。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]本专利技术提供一种人GLI1蛋白Ser937位点磷酸化抗体的制备方法，包括如下步骤：
[0009](1)确定人GLI1 Ser937蛋白磷酸化位点；
[0010]本专利技术通过如下方式进行确定：
[0011]1、通过生物信息学分析筛选人GLI1蛋白中可能发生磷酸化位点，锁定了GLI1中7个主要符合“SP”排列的Ser(S)位点：S70、S569、S686、S885、S927、S937、S968为潜在位点。
[0012]2、利用点突变试剂盒构建GLI1点突变质粒，方案是将这些S位点替换成不能被磷酸化修饰的丙氨酸(A)，经测序验证构建成功。
[0013]3、293T细胞中共转染8
×3’
Gli
‑
BS
‑
Luc荧光素酶报道基因质粒、Renilla海肾荧光素酶报道基因质粒，与上述GLI1点突变质粒，48h后利用双荧光素酶报告基因检测系统检测Gli荧光素酶报告基因活性。结果显示：与野生型相比，S885A和S927A突变体上调报告基因活性约40％，而S937A突变体可以上调260％(如图1所示)，最终确定人GLI1蛋白特异性磷酸化位点Ser937。
[0014](2)根据GLI1靶点序列及已知的磷酸化位点Ser937，设计需要合成的磷酸化及非磷酸化多肽序列；
[0015](3)合成氨基酸序列的抗原合成肽，将该多肽与载体蛋白偶联用作抗原；
[0016](4)将步骤(3)合成的抗原合成肽免疫动物并收集抗血清；
[0017]该免疫动物优选新西兰白兔，共免疫6次，前3次免疫2周一次，后3次免疫，1周1次。
[0018]第一次免疫每兔500μg多肽抗原，之后每次免疫每兔250μg多肽抗原，于第3次免疫一周后采少量血清进行ELISA检测，第6次加强免疫一周后放全血得到兔多抗血清。
[0019](5)将步骤(4)收集的抗血清进行纯化和鉴定，得到人GLI1蛋白Ser937位点磷酸化抗体。
[0020]所述步骤(3)中的磷酸化多肽序列为：PAQEPSYQp[S937]PKFLG
‑
Cys。
[0021]优选地，所述步骤(3)中的合成多肽的方式为固相合成法，并通过HPLC条件进行纯化，且纯度>95％。
[0022]优选地，所述步骤(3)中的载体蛋白为钥孔血蓝蛋白。
[0023]优选地，所述步骤(5)中的鉴定方式为：通过ELISA检测。
[0024]ELISA检测流程如下：
[0025]①
将抗原(肽)用碳酸盐缓冲液稀释至5μg/ml，向ELISA板上的对应孔中添加100μl抗原；4℃孵育过夜；
[0026]②
弃去液体，洗涤缓冲液冲洗两次；
[0027]③
每孔加入200μl封闭缓冲液，在室温下孵育2小时；
[0028]④
弃去封闭缓冲液，用清洗缓冲液清洗平板三次；
[0029]⑤
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人GLI1蛋白Ser937位点磷酸化抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)确定人GLI1 Ser937蛋白磷酸化位点；(2)根据GLI1靶点序列及已知的磷酸化位点Ser937，设计需要合成的磷酸化及非磷酸化多肽序列；(3)合成氨基酸序列的抗原合成肽，将该多肽与载体蛋白偶联用作抗原；(4)将步骤(3)合成的抗原合成肽免疫动物并收集抗血清；(5)将步骤(4)收集的抗血清进行纯化和鉴定，得到人GLI1蛋白Ser937位点磷酸化抗体。2.如权利要求1所述的一种人GLI1蛋白Ser937位点磷酸化抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的磷酸化多肽序列为：PAQEPSYQp[S937]PKFLG
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【专利技术属性】
技术研发人员：吴希美，王继荣，姚敏俐，唐超，何强强，许成云，曾玲晖，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：