一种使用蛋白A亲和层析法纯化生物活性肽的方法技术

本发明专利技术提供一种使用包含含有蛋白A配体的亲和基质的亲和色谱柱纯化含有Fc的生物活性肽混合物的方法，其中，所述含有Fc的生物活性肽包含第一含有Fc的生物活性肽和第二含有Fc的生物活性肽，其中，与所述第一含有Fc的生物活性肽相比，所述第二含有Fc的生物活性肽还包含至少一个VH3结构域。根据所述纯化方法，在实现简化工序的同时，可以精确地高纯度分离具有相同或相似结构的生物活性肽。相同或相似结构的生物活性肽。相同或相似结构的生物活性肽。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种使用蛋白A亲和层析法纯化生物活性肽的方法


[0001]本专利技术涉及一种使用蛋白A亲和层析法纯化含有Fc的生物活性肽的方法，更具体地，涉及利用根据包含在含有Fc的生物活性肽中的人VH3结构域的数量差异引起的与蛋白A的结合力差异，从肽20混合物中高纯度纯化特定肽的方法。

技术介绍

[0002]为分离特定肽，使用多种纯化方法。例如，使用离子交换层析法、疏水层析法、尺寸排阻层析法、亲和层析法等。
[0003]然而，如果是相似结构的肽，等电点、疏水性(hydrophobicity)、大小差异和亲和力差异不大，通过一般的纯化方法难以获得高纯度的特定肽。在这种情况下，已知许多通过人为改变序列引起所需的特定肽与除了该特定肽之外可能产生的肽之间的等电点和亲和力差异，并将其用于纯化方法的方法。在这两种情况下，根据人为改变序列以提高等电点或亲和力的差异，特定肽的理化性质会发生改变，并且由此可诱发无法预料的免疫原性等。

技术实现思路

[0004]技术问题
[0005]本专利技术的一个目的在于，提供一种通过亲和层析法从肽混合物或抗体混合物中高纯度纯化含有Fc的生物活性肽或抗体的方法，其利用根据生物活性肽混合物中包含的含有Fc生物活性肽的人VH3结构域的数量差异引起的蛋白A的结合力差异。更具体地，在亲和力或等电点特质的差异不大，但在VH3结构域数量方面存在差异的肽一起被制备的情况下，根据肽中包含的VH3结构域的数量，与全域(full domain)蛋白A的亲和力会不同，因此，本专利技术的一个目的在于，提供一种获得高纯度的所需的肽的方法，其通过亲和层析法将肽根据VH3结构域的数量分离，其中，所述亲和层析法利用VH3结构域数量不同的肽与全域蛋白A的亲和力差异。
[0006]特别地，本专利技术的一个目的在于，提供一种在制备不对称异二聚体(asymmetric heterodimer)蛋白质的过程中同时产生了不需要的对称同型二聚体(symmetric homodimer)的情况下，根据包含在各个蛋白质的VH3结构域的数量差异分离纯化不对称异二聚体蛋白质和对称同型二聚体蛋白质的方法。
[0007]技术方案
[0008]本专利技术中公开的每个描述和实施例也可适用于各个不同的描述和实施例。即，本专利技术中公开的各种要素的所有组合都属于本专利技术的范围。
[0009]此外，不能认为本专利技术的范围受以下具体描述的限制。
[0010]本说明书中的第一、第二等术语可以用于说明各种组成元件，但所述组成元件不应该受所述术语的限制。所述各个术语仅用于区分一个组成元件与其他组成元件的目的。例如，在不脱离本专利技术的权利范围的情况下，第一组成元件可以被命名为第二组成元件，类似地，第二组成元件也可以被命名为第一组成元件。除非上下文另有明确规定，否则单数表
达包含复数表达。
[0011]除非另有定义，否则本说明书中使用的所有术语(包含技术术语和科学术语)与本专利技术所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。此外，诸如在常用词典中定义的术语之类的术语应该被解释为具有与其在相关
中上下文中的含义一致的含义，并且本文中明确地如此定义，除非以理想化或过度正式的意义来进行解释。
[0012]应该理解为，诸如“包含”或“含有”之类的术语旨在指定说明书中描述的特征、数字、步骤、操作、组成元件或其组合的存在，并不预先排除存在或添加一个或多个其他特征或数字、步骤、操作、组成元件或其组合的可能性。
[0013]“和/或”包含任何相关组成可以定义的一个或多个组合。
[0014]本专利技术所用术语“生物活性肽”是一个包含表现一种或多种生物活性的肽、多肽、蛋白质、蛋白质的一部分和融合蛋白等的概念，并且不受特定分子量至氨基酸的长度、种类等的限制。
[0015]本专利技术所用术语“含有Fc的生物活性肽”是指包含抗体中发现的Fc区(fragment crystallizable region，可结晶片段区)的生物活性肽。例如，所述含有Fc的生物活性肽是包含含有Fc区的抗体的物质。
[0016]本专利技术可以提供一种从含有Fc的生物活性肽混合物中分离和/或纯化含有Fc的生物活性肽的方法。
[0017]如本文所用，生物活性肽是指传递到生物体并调节生物体功能的肽，例如，调节激素、细胞因子、酶、抗体、生长因子、转录调节因子、血液因子、疫苗、结构蛋白、配体蛋白或受体等的生物体功能的肽可以被定义为生物活性物质，例如，上述的肽可以是连接于Fc的N
‑
末端或C
‑
末端的形式。
[0018]根据本专利技术的一实施例提供一种纯化含有Fc的生物活性肽的方法，其包含以下步骤：(a)将含有Fc的生物活性肽混合物装载到包含含有蛋白A配体的亲和基质的色谱柱上，所述生物活性肽混合物包含第一含有Fc的生物活性肽和第二含有Fc的生物活性肽，其中，与所述第一含有Fc的生物活性肽相比，所述第二含有Fc的生物活性肽还包含至少一个人VH3结构域；以及(b)将洗脱液装载到所述色谱柱上，根据包含在所述生物活性肽混合物中的所述含有Fc的生物活性肽各自包含的人VH3结构域的数量，在彼此不同的pH下，分离和洗脱所述含有Fc的生物活性肽。
[0019]在一实施例中，与所述第一含有Fc的生物活性肽相比，所述第二含有Fc的生物活性肽还包含至少一个人VH3结构域，或者还可以包含至少一个与人VH3结构域具有大于或等于95％、大于或等于90％、大于或等于80％、或大于或等于70％同源性的氨基酸序列。人VH3结构域是位于VH3家族人类抗体的重链可变区的CDR2和CDR3之间的氨基酸序列，可以包含SEQ ID No.23至SEQ ID No.37中的任意一种序列，但不限于此，并且只要是本领域技术人员可以容易地确定蛋白质中包含的人VH3结构域序列。所述人VH3结构域主要位于VH3家族人类抗体中，但罕见的，可在小鼠等哺乳动物(或嵌合体)抗体框架中被发现。例如，本专利技术的实施例使用的hu11F11是包含人VH3结构域的抗体，ch1E4和抗BACE(anti
‑
BACE)抗体是不包含人VH3结构域的抗体。只是，例外地，ch11F11虽然是一种嵌合抗体，但依然是包含人VH3结构域的抗体。
[0020]所述蛋白A配体可以是全域蛋白A配体。即，蛋白A配体可以包含所有全域(E、D、A、B
和C结构域)。但是，实施例并不限于此，并且所述蛋白A配体可以包含选自E结构域和D结构域中的一个或多个结构域。例如，所述蛋白A配体可以包含E结构域和D结构域。
[0021]所述用于支持亲和基质中的蛋白A配体的支持体可以是具有球(spherical)状等珠(bead)状形态的颗粒。所述亲和基质中所述支持体的平均粒径可以是例如约小于90μm，例如约小于或等于80μm或小于或等于75μm。此外，所述亲和基质中所述支持体的平均粒径，可以是例如约大于或等于1μm或者大于或等于5μm。在所述亲和基质中所述支持体的大小满足上述范围的情况下，生物活性肽的分辨率可能会更优异。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种纯化含有Fc的生物活性肽的方法，其包含以下步骤：(a)将含有Fc的生物活性肽混合物装载到包含含有蛋白A配体的亲和基质的色谱柱上，所述生物活性肽混合物包含第一含有Fc的生物活性肽和第二含有Fc的生物活性肽，其中，与所述第一含有Fc的生物活性肽相比，所述第二含有Fc的生物活性肽还包含至少一个人VH3结构域；以及(b)将洗脱液装载到所述色谱柱上，根据包含在所述生物活性肽混合物中的所述含有Fc的生物活性肽各自包含的人VH3结构域的数量，在彼此不同的pH下，分离和洗脱所述含有Fc的生物活性肽。2.根据权利要求1所述的纯化方法，所述生物活性肽混合物还包含第三含有Fc的生物活性肽，其与所述第二含有Fc的生物活性肽相比，还包含至少一个人VH3结构域。3.根据权利要求2所述的纯化方法，所述生物活性肽混合物包含：所述第一含有Fc的生物活性肽，其包含n个(n为0以上的整数)人VH3结构域；所述第二含有Fc生物活性肽，其包含n+1个人VH3结构域；以及所述第三含有Fc生物活性肽，其包含n+2个人VH3结构域。4.根据权利要求1所述的纯化方法，所述步骤(b)包含以下步骤：(b1)将具有第一pH范围的洗脱液装载到所述色谱柱上以洗脱所述第一含有Fc的生物活性肽；以及(b2)将具有比所述第一pH范围低的第二pH范围的洗脱液装载到所述色谱柱上以洗脱所述第二含有Fc的生物活性肽。5.根据权利要求2所述的纯化方法，所述步骤(b)还包含以下步骤：(b1)将具有第一pH范围的洗脱液装载到所述色谱柱上以洗脱所述第一含有Fc的生物活性肽；(b2)将具有比所述第一pH范围低的第二pH范围的洗脱液装载到所述色谱柱上以洗脱所述第二含有Fc的生物活性肽；以及(b3)使用具有比所述第二pH范围低的第三pH范围的洗脱液洗脱所述第三含有Fc的生物活性肽。6.根据权利要求1所述的纯化方法，所述Fc是未导入影响与野生型蛋白A的结合力的突变。7.根据权利要求1所述的纯化方法，在所述第一或第二含有Fc的生物活性肽包含VH3结构域的情况下，所述第一或第二含有Fc的生物活性肽包含选自以下序列的含有VH结构域的可变区序列：SEQ ID No.1的重链可变序列和SEQ ID No.2的轻链可变序列；SEQ ID No.3的重链可变序列和SEQ ID No.4的轻链可变序列；SEQ ID No.5的重链可变序列和SEQ ID No.6的轻链可变序列；SEQ ID No.7的重链可变序列和SEQ ID No.8的轻链可变序列；或者SEQ ID No.9的重链可变序列和SEQ ID No.10的轻链可变序列。8.根据权利要求2所述的纯化方法，所述第三含有Fc的生物活性肽包含选自以下序列的含有VH结构域的可变区序列：
SEQ ID No.1的重链可变序列和SEQ ID No.2的轻链可变序列；SEQ ID No.3的重链可变序列和SEQ ID No.4的轻链可变序列；SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋大海，朴泳燉，郑镇沅，洪庭铉，林嬉珍，金东寅，
申请(专利权)人：爱必乐生物公司，
类型：发明
国别省市：