本发明专利技术公开了一种白术内生真菌及其在促进白术种子萌发、幼苗生长中的应用，属于植物内生真菌资源利用与植物生长调控技术领域。所述的内生真菌是从菊科苍术属植物白术活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，分类命名为竹黄菌AM90(Shiraia sp.)，菌种保藏号为CGMCC No.40299。本发明专利技术同时公开了所述内生真菌的用途：能促进白术种子萌发，加快幼苗生长，并上调白术isp、HSP22.7、yfmJ基因表达。本发明专利技术的内生真菌对白术种子萌发与幼苗生长有显著的促进作用，为白术实生苗培育及大田高产栽培技术领域带来广阔的应用前景。技术领域带来广阔的应用前景。技术领域带来广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种白术内生真菌及其在促进白术种子萌发、幼苗生长中的应用
[0001]本专利技术涉及植物内生菌资源利用与植物生长发育
，具体地说，是一种白术内生真菌及其对促进白术种子萌发，加快幼苗生长的应用。
技术介绍
[0002]中药白术系菊科苍术属植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎，为浙江省著名道地药材“浙八味”之一，性温，味苦、甘，归脾、胃经，具有健脾益气，燥湿利水，止汗，安胎等功效。白术临床应用广泛，被誉为“健脾补气第一要药”，素有“十方九用”、“南术北参”之称。现代化学与药理学研究表明，白术中富含多糖、萜类、酚酸类、黄酮类、香豆素类、甾醇类等多种活性成分，具有抗肿瘤、调节胃肠道、抗骨质疏松、抗炎、抗衰老、抗氧化、免疫调节等作用，是临床常用的大宗药材。
[0003]植物内生真菌(Endophytic fungus)是指存在于健康植物根茎叶等组织内部，不会对宿主植物造成明显伤害或者引起宿主植物组织明显病症的真菌。内生真菌能促进植物生长发育与次生代谢产物积累，提高植物抗病原微生物与非生物胁迫的能力。同时，内生真菌能产多种具有生物活性的代谢物质。有学者报道，广谱内生真菌枫香拟茎点霉B3接种可以缓解连作花生叶片衰老，增加根部生长素积累，生长素的积累增强了花生根部碳代谢和糖转运基因的表达，进而促进了糖向根部的转运和积累，为花生结瘤固氮提供了更多的能量，促进了结瘤固氮，增加植株氮素水平。张捷等从春砂仁内生真菌Letendraea helminthicola A696的发酵液中分离得到了一种新的倍半萜类化合物11
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hydroxyl tricinonoic acid，对其进行了抗菌和抗肿瘤活性试验，结果表明该化合物在100μg/mL浓度下无抗菌和抗肿瘤活性。马建苹等从百合内生真菌Fusarium sp.(GBH2J7)的发酵产物中分离得到对羟基苯乙醇和水杨酸两种酚类物质，其中对羟基苯乙醇是活性指导分离得到的化合物，有DPPH自由基清除活性。总之，植物内生真菌是一种重要的微生物资源，其合理开发利用对植物(药用植物)的生产与发展具有重要意义。
[0004]内生真菌诱导子是内生真菌产生的诱导植物细胞合成次生代谢产物的一类物质，真菌诱导子能够启动信号转导途径，激活基因转录及表达，一定程度提高了关键酶活性，从而促进某些次生代谢物的生物合成，促进植株生长发育，增强植株自身抗性。如丹参中分离得到的深绿木霉Trichoderma atroviride D16产生的PSF蛋白多糖诱导子，可以促进丹参毛状根的生长，并刺激丹参酮含量积累，深入分析发现D16菌丝PSF主要是通过亮氨酸重复元件、Ca
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、过氧化物、蛋白磷酸化和茉莉酸合成等信号转导途径调节丹参毛状根糖类和氨基酸的合成与代谢以及基因的转录和蛋白质的翻译过程，进而导致次生代谢相关酶蛋白表达量的变化，最终影响丹参毛状根的整体代谢轮廓发生变化。罗琳等研究报道多孔菌科(Polyporaceae)毛栓菌(Trametes hirsuta)制备的真菌诱导子能显著缩短白芨种子的萌发时间，而且其幼苗鲜重增长量是对照组的5.4倍，株高是对照组的3.7倍。因此，真菌诱导子是一类重要的活性因子，在植物生长发育与次生代谢等方面具有广阔的应用前景。
[0005]但是，关于白术内生真菌诱导子促进白术种子萌发与幼苗生长的应用目前还未见报道。
技术实现思路
[0006]本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种白术内生真菌及其对促进白术种子萌发、幼苗生长的应用。
[0007]本专利技术的第一方面，提供了一种药用植物内生真菌，命名为AM90。所述的内生真菌是从菊科苍术属植物白术活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，经微生物分类学鉴定为子囊菌门竹黄菌属竹黄菌AM90(Shiraia sp.)。该菌株已保藏，菌株保藏编号为CGMCC No.40299，保藏日期为2022年9月5日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为100101。
[0008]本专利技术所述的内生真菌的固体培养特征为：在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上26℃暗培养，生长较快，菌落整体白色，底部见淡红色分泌物，菌丝显见，前缘整齐，密度大，边缘呈圆状，见图1。
[0009]本专利技术所述的内生真菌在光学显微镜下的菌丝形态为：菌丝较细，表面平展光滑，无隔膜，壁薄，半透明，直径5
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20μm，无分生孢子，见图2。
[0010]本专利技术所述的内生真菌的ITS序列扩增电泳图见图3，碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
[0011]将上述序列于NCBI网站进行序列比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，发现同Shiraia sp.(JX875938)菌株处于同一末端分支，且同源性均为99.78％。下载同源与近属序列，以Jahnula appendiculata(JN819280)做外群，用MEGA7.0做多序列比对，用邻接法(Neighbor
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joining，NJ)分析，重复比对1000次。本专利技术所述内生真菌的系统进化树见图4。
[0012]本专利技术所述的内生真菌在马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)上26℃培养，生长较快，发酵液整体呈暗红色，中等粘稠，隐约可见菌丝团，数量众多，团块较小，见图5。
[0013]本专利技术的第二方面，提供上述内生真菌发酵制备的粗多糖诱导子在促进白术种子萌发，加快幼苗生长中的应用。
[0014]所述的上述应用，AM90粗多糖通过喷洒的方式，促进白术种子萌发，并加快幼苗生长，所述诱导子是采用所述的内生真菌通过PDB培养基制备得到，PDB培养基的配方是：200g土豆，20g葡萄糖，1000mL蒸馏水，pH自然。
[0015]进一步地，AM90多糖诱导子是按照以下步骤制备：(1)取所述的内生真菌菌种，在无菌条件下，挑取菌丝，接入已灭菌的PDA培养基，26℃，65％湿度条件下暗培养7d。(2)无菌条件下，在菌落边缘打取菌饼接种于已灭菌的PDB培养基中，在26℃，180r/min条件下恒温震荡培养7d，得种子液。将种子液倒入PDB培养基中，在26℃，180r/min条件下震荡培养14d，将制备好的发酵液经布氏漏斗抽滤，得到干燥固体菌丝块。(3)将菌丝置于40℃烘箱中烘干至恒重，取20g菌丝按料液比(W/V)等于1:20加入纯水，高压蒸汽灭菌锅121℃高温提取90min，旋转蒸发浓缩，然后加入4倍体积无水乙醇，室温过夜。(4)4000r/min离心10min，取沉淀，旋涡溶解后冻干至粉末。(5)取粉末，加入无菌水溶解，即得。
[0016]进一步地，PDA培养基的配方是：200g土豆，20g葡萄糖，1000mL蒸馏水，15g琼脂，pH
自然；PDB培养基的配方是：200g土豆，20g葡萄糖，1000mL蒸馏水，pH自然。
[0017]进本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种白术内生真菌，其特征在于，从菊科苍术属植物白术活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，于2022年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为竹黄菌AM90(Shiraia sp.)，保藏编号为CGMCC No.40299。2.一种权利要求1所述白术内生真菌在促进白术种子萌发、幼苗生长中的应用，其特征在于，所述应用为：将内生真菌AM90制备的多糖诱导子按照浸种与喷洒的方式分别对白术种子和/或幼苗进行施用，促进白术种子萌发和/或幼苗生长。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，AM90多糖诱导子是按照以下步骤制备：(1)取所述的内生真菌菌种，在无菌条件下，挑取菌丝，接入已灭菌的PDA培养基，26℃，65％湿度条件下暗培养7d；(2)无菌条件下，在菌落边缘打取菌饼接种于已灭菌的PDB培养基中，在26℃，180r/min条件下恒温震荡培养7d，得种子液；将种子液倒入PDB培养基中，在26℃，180r/min条件下震荡培养14d，将制备好的发酵液经布氏漏斗抽滤，得到干燥固体菌丝块；(3)将菌丝块置于40℃烘箱中烘干至恒重，取20g菌丝，按料液比为1:20加入纯水，高压...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄情儿，朱波，秦路平，吴建军，秦烨，
申请(专利权)人：浙江中医药大学，
类型：发明
国别省市：
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