一种利用球毛壳菌DX-THS3生产β-葡萄糖苷酶的方法及应用技术

本发明专利技术属于真菌发酵技术领域，本发明专利技术提供了一种利用球毛壳菌DX

【技术实现步骤摘要】
一种利用球毛壳菌DX
‑
THS3生产
β
‑
葡萄糖苷酶的方法及应用


[0001]本专利技术涉及真菌发酵
，尤其涉及一种利用球毛壳菌DX
‑
THS3生产β
‑
葡萄糖苷酶的方法及应用。

技术介绍

[0002]异甘草苷(Isoliquiritin，ISL)是甘草提取物的主要生物活性黄酮类成分之一，因其具有抗氧化、抗溃疡、治疗抑郁性精神病、艾滋病、辅助治疗糖尿病等生理活性，在食品和医药工业中得到了广泛的应用，但它的吸收率低，在动物和人体内会多种不良影响，从而限制了其应用。幸运的是，异甘草苷可以水解生成异甘草素，其生理活性更强，生物利用度更高，不良反应更少。目前，异甘草素可通过化学合成或生物转化制备。一般而言，化学合成选择性差，成本无效，会造成环境污染。异甘草苷的生物转化利用β
‑
D
‑
葡萄糖苷酶(β
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glucosidase，GUS，EC3.2.1.21)，具有高产率、高选择性和环境友好等优点，比化学合成更具潜力。因此，研究如何高效、选择性地合成异甘草苷产生异甘草素，应予以强烈考虑。
[0003]β
‑
葡萄糖苷酶可以从众多的微生物、植物和动物中筛选得到；大多数异甘草苷生物转化的异甘草素主要是从微生物特别是丝状真菌中分离得到的，由于异甘草素含量较低，不能直接从宿主中获得。因此，发酵是利用丝状真菌生产β
‑
葡萄糖苷酶的最有潜力的方法，但由于丝状真菌复杂的形态结构显著降低了发酵过程中的质量和氧转移，阻碍了其在生产中的应用。例如，与其他真菌形态相比，丝状真菌的颗粒形态能显著提高柠檬酸或衣康酸的产量，有证据表明真菌的丝状形态对发酵过程中异甘草素的产生有显著影响。因此，设计丝状真菌的形态成为真菌发酵大规模生产β
‑
葡萄糖苷酶或异甘草素的挑战之一。
[0004]一般情况下，丝状真菌的形态很难控制，尤其是在生物反应器发酵过程中。丝状真菌的形态对其在发酵过程中的代谢和产物有重要影响，在液体深层发酵中，丝状真菌可以生长出多种形态，包括游离的菌丝，菌丝分散在发酵液中；光滑的、毛茸茸茸的菌丝团，核心可见高度缠绕的菌丝网络；松散的菌丝团，大的密集聚集的菌丝。丝状真菌在发酵过程中的形态会受到多种因素的影响，包括pH、培养基位置、接种量、培养基剪切、培养温度、培养基黏度等。以往的研究对丝状真菌的形态进行了研究，并试图对其进行工程化，以改善其发酵性能。但丝状真菌的形态控制尤其是在深层发酵过程中较为困难。很少有学者成功地对丝状真菌的形态进行了工程化，并报道了发酵性能的显著改善。Hasan B et al.研究表明，在曲霉发酵培养基中添加氧化铝和滑石粉可显著提高植酸酶活性。Zhang et al.研究发现，豆粕水解物作为氮源对米根霉后续发酵过程中的形态和富马酸产量有显著影响。在我们前期的研究中，我们从内生植物真菌球毛壳菌Chaetomium globosum DX
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THS3中筛选出一种高效、高底物选择性的GUS(称为cg
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GUS)。在摇瓶中研究了球茎藻DX
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THS3发酵生产GAMG和cg
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GUS的过程，球毛壳菌DX
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THS3的菌体形态适合于GUS的生产。在发酵培养基中添加10g/L的二氧化硅(600目)设计球茎藻DX
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THS3的颗粒形态，获得了576U/mL的GUS活性，但添加二氧化硅的过程工程面临成本不高、设备破坏、产品分离困难等挑战，给生物反应器大规模生产GUS带来困难。因此，研究一种正确合适的生产方法对于大规模生产β
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葡萄糖苷酶和在不
附加任何条件下设计真菌形态具有重要意义。
[0005]氮源对微生物发酵产物有重要影响。Xing et al.分析了5种氮源对延胡索酸生产的影响：他们发现不同的氮源对延胡索酸有很大的影响。Li等人报道了不同的氮源对移动发酵单胞菌发酵细胞生长、葡萄糖利用和乙醇生产有显著影响。目前，关于氮源对球毛壳菌DX
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THS3发酵生产β
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葡萄糖苷酶的影响还未见报道。

技术实现思路

[0006]为克服现有技术中存在的上述缺陷，本专利技术通过添加不同的氮源来控制球茎藻DX
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THS3的形态，提供了一种利用球毛壳菌DX
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THS3生产高活性β
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葡萄糖苷酶的方法及应用。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0008]本专利技术提供了一种利用球毛壳菌DX
‑
THS3生产β
‑
葡萄糖苷酶的方法，包括如下步骤：
[0009](1)将球毛壳菌DX
‑
THS3置于种子培养基上进行振荡培养，得球毛壳菌DX
‑
THS3种子悬浮液；
[0010](2)将上述所得球毛壳菌DX
‑
THS3种子悬浮液置于发酵培养基上进行发酵培养，得球毛壳菌DX
‑
THS3发酵产物，所述发酵培养基的氮源包括酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、豆粕和玉米浆粉中的一种；所述发酵培养基中氮源的浓度为2～7g/L；
[0011](3)将上述所得球毛壳菌DX
‑
THS3发酵产物进行放大发酵培养，得球毛壳菌DX
‑
THS3放大发酵培养产物，每隔11～13h取样，测定菌体干重和酶活。
[0012]优选的，步骤(1)中所述球毛壳菌DX
‑
THS3的接种量为种子培养基体积的1～4％，所述种子培养基，以水为溶剂，包括以下浓度的组分：马铃薯180～220g/L，葡萄糖18～22g/L和酵母膏0.1～0.3g/L。
[0013]优选的，步骤(1)中所述振荡培养的频率为120～180rpm，所述振荡培养的温度为25～30℃，所述振荡培养的时间为2～4d。
[0014]优选的，步骤(2)中所述发酵培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：蔗糖4～6g/L，KH2PO
4 3～4g/L，氮源2～7g/L，NaCl 0.4～0.6g/L，MgSO4·
7H2O 0.4～0.6g/L，ZnSO4·
7H2O 0.002～0.003g/L，NaMoO4·
2H2O 0.0002～0.0003g/L，MnSO4·
H2O 0.001～0.003g/L，CaCl
2 0.01～0.02g/L和H3BO
3 0.00002～0.00004g/L。
[0015]优选的，步骤(2)中所述发酵培养的接种量为2～4％；
[0016]所述发酵培养的温度为25～30℃；
[0017]所述发酵培养的时间为6～10d；
[0018]所述发酵培养为振荡培养，所述振荡的频率为120～180rpm。
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用球毛壳菌DX
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THS3生产β
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葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将球毛壳菌DX
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THS3置于种子培养基上进行振荡培养，得球毛壳菌DX
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THS3种子悬浮液；(2)将上述所得球毛壳菌DX
‑
THS3种子悬浮液置于发酵培养基上进行发酵培养，得球毛壳菌DX
‑
THS3发酵产物，所述发酵培养基的氮源包括酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、豆粕和玉米浆粉中的一种；所述发酵培养基中氮源的浓度为2～7g/L；(3)将上述所得球毛壳菌DX
‑
THS3发酵产物进行放大发酵培养，得球毛壳菌DX
‑
THS3放大发酵培养产物，每隔11～13h取样，测定菌体干重和酶活。2.根据权利要求1所述的一种利用球毛壳菌DX
‑
THS3生产β
‑
葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，步骤(1)中所述球毛壳菌DX
‑
THS3的接种量为种子培养基体积的1～4％，所述种子培养基，以水为溶剂，包括以下浓度的组分：马铃薯180～220g/L，葡萄糖18～22g/L和酵母膏0.1～0.3g/L。3.根据权利要求1或2所述的一种利用球毛壳菌DX
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THS3生产β
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葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，步骤(1)中所述振荡培养的频率为120～180rpm，所述振荡培养的温度为25～30℃，所述振荡培养的时间为2～4d。4.根据权利要求3所述的一种利用球毛壳菌DX
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THS3生产β
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葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，步骤(2)中所述发酵培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：蔗糖4～6g/L，KH2PO
4 3～4g/L，氮源2～7g/L，NaCl 0.4～0.6g/L，MgSO4·
7H2O 0.4～0.6g/L，ZnSO4·
7H2O 0.002～0.003g/L，NaMoO4·
2H2O 0.0002～0.0003g/L，MnSO4·
H2O 0.001～0.003g/L，CaCl
2 0.01～0.02g/L和H3BO
3 0.00002～...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖依文，朱笃，汪涯，高波良，吴文婷，黄弯凤，梁伟中，
申请(专利权)人：江西科技师范大学，
类型：发明
国别省市：