本申请公开了一种疫霉和细菌的共生体系及其分析方法和应用。本申请的疫霉和细菌的共生体系中，疫霉为Phytophthora syringae、Phytophthora cactorum或Phytophthorafragariae var.rubi，细菌为Pandoraea sputorum或Achromobacter insolitus。本申请率先研究和发现了疫霉和细菌的共生体系，为疫霉引起的植物病害的防治提供了一种新的方案和途径。疫霉属于卵菌纲，本申请率先在卵菌纲的真菌中发现共生细菌的现象，对真菌和细菌共生体系的研究具有重要意义。义。义。
【技术实现步骤摘要】
一种疫霉和细菌的共生体系及其分析方法和应用
[0001]本申请涉及真菌和细菌的共生
，特别是涉及一种疫霉和细菌的共生体系及其分析方法和应用。
技术介绍
[0002]在植物界，植物细胞内共生细菌和真核生物机制已广为知晓，研究最多的是菌根，这一真菌和植物根的互惠共生体。除了植物根与真菌的共生体系以外，有研究显示，部分真菌和细菌也能够组成共生体系，例如，球囊菌门(Glomeromycota)、毛霉菌亚门(Mucoromycotina)、子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)中的部分真菌，都存在共生现象。
[0003]研究显示，在真菌和细菌的共生体系中，细菌能够促进共生体系的营养吸收，影响真菌菌丝的生长、细胞质形成、液泡形态、细胞壁形成、液态基质和色素颗粒化。并且，共生体系中的细菌与无性繁殖、产生毒素致病、改善适应性、提高存活力和抗病性有关。
[0004]目前，除了Glomeromycota、Mucoromycotina、Ascomycota和Basidiomycota中的部分真菌存在共生以外，尚未有发现其他门或分类中的真菌的共生体系。然而，共生体系是普遍存在的自然现象，研发更多的共生体系，尤其是和植物相关的真菌或细菌的共生体系，对促进植物生长、病害防治等具有重要意义。
技术实现思路
[0005]本申请的目的是提供一种新的疫霉和细菌的共生体系及其分析方法和应用。
[0006]本申请采用了以下技术方案：
[0007]本申请的一方面公开了一种疫霉和细菌的共生体系，该共生体系中的疫霉为Phytophthorafragariae var.rubi、Phytophthora syringae或Phytophthora cactorum，共生体系中的细菌为Pandoraea sputorum或Achromobacter insolitus。
[0008]需要说明的是，本申请率先研究和发现了疫霉和细菌的共生体系，并通过大量的验证和排除实验，对疫霉和细菌的共生体系进行了证明，最终确认Phytophthorafragariae var.rubi、Phytophthora cactorum或Phytophthorasyringae这三种疫霉菌种，与Pandoraea sputorum或Achromobacter insolitus这两种细菌之间存在共生现象。本申请的疫霉和细菌的共生体系，为疫霉引起的植物病害的防治提供了一种新的方案和途径。
[0009]本申请的一种实现方式中，共生体系为共生体系为Phytophthorafragariae var.rubi或Phytophthora cactorum，与Pandoraea sputorum的共生体系；或者，Phytophthora syringae与Achromobacter insolitus的共生体系。
[0010]需要说明的是，Phytophthorafragariae var.rubi或Phytophthora cactorum与Pandoraea sputorum的共生体系；Phytophthora syringae与Achromobacter insolitus的共生体系；这只是本申请的一种实现方式中发现的具体的共生体系案例，不排除这三种疫霉和两种细菌之间还有其他的组合方式。
[0011]本申请的一种实现方式中，Pandoraea sputorum为Pandoraea sputorum strain CUB2S；Achromobacter insolitus为Achromobacter insolitus strain Sn1。
[0012]需要说明的是，Pandoraea sputorum strain CUB2S和Achromobacter insolitus strain Sn1只是本申请的一种实现方式中，通过序列比对确定的Pandoraea sputorum和Achromobacter insolitus的具体菌株。
[0013]本申请的另一面公开了一种疫霉和细菌共生体系的分析方法，包括分离培养步骤、荧光显微镜和/或透射电镜观察步骤、核酸测序验证步骤；分离培养步骤，包括取待分析疫霉样本的菌丝，将其分散于水中，使菌丝破裂，然后进行离心，取上清液涂布于营养琼脂平板上恒温培养至少10h，观察营养琼脂平板上是否存在细菌样有机物；荧光显微镜和/或透射电镜观察步骤，包括对存在细菌样有机物的菌丝进行荧光显微镜观察，或者透射电镜观察，进一步确认待分析疫霉样本是否存在共生的细菌；核酸测序验证步骤，包括分别提取待分析疫霉样本的菌丝的DNA，以及所述细菌样有机物的DNA，对菌丝的DNA进行ITS和16S rRNA测序，对细菌样有机物的DNA进行16S rRNA测序，通过菌丝的DNA的ITS和16S rRNA测序，进一步验证疫霉和细菌共生体系的存在，对测序结果进行比对，确定待分析疫霉样本中疫霉的具体种或菌株，以及共生系统中细菌的具体种或菌株。
[0014]需要说明的是，本申请研究发现疫霉和细菌存在共生现象后，创造性的研发了一种能够准确有效的分析疫霉和细菌共生体系的方法，通过本申请的方法最终确认了疫霉为Phytophthorafragariae var.rubi、Phytophthora cactorum或Phytophthorasyringae，细菌为Pandoraea sputorum或Achromobacter insolitus，组成的疫霉和细菌共生体系。可以理解，采用本申请分析方法，不排除还可以研发更多的疫霉和细菌共生体系。
[0015]本申请的一种实现方式中，分离培养步骤，还包括在菌丝分散于水中后，用移液枪反复吹打菌丝，使其破裂。
[0016]本申请的一种实现方式中，还包括在离心取上清液时，分两轮进行离心，第一轮以不超过500rpm的速度离心不超过5min，获取第一轮离心上清液，然后再对第一轮离心上清液进行第二轮离心，第二轮离心的速度为至少4000rpm，离心时间不少于20min，获得第二轮离心的上清液，分别将第一轮离心上清液和第二轮离心上清液涂布于营养琼脂平板上进行恒温培养。
[0017]本申请的一种实现方式中，恒温培养的温度为30℃。
[0018]本申请的一种实现方式中，荧光显微镜观察包括，将菌丝转移至0.85％的NaCl溶液中，分散均匀后，取混合液于玻片上，加入核酸染料进行染色，然后采用荧光显微镜观察。
[0019]本申请的一种实现方式中，加入核酸染料进行染色，具体包括，加入SYTO9绿色荧光核酸染料，并加入等量的碘化丙啶染料，黑暗条件下孵化至少15min，加入ProLong Gold antifade reagent，再孵育至少20min，然后在480/500nm波长条件下进行荧光显微镜观察。
[0020]本申请的一种实现方式中，透射电镜观察包括，将固体培养基培养的待分析疫霉样本或其菌丝，转移至2.5
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种疫霉和细菌的共生体系，其特征在于：所述共生体系中的疫霉为Phytophthorafragariae var.rubi、Phytophthora cactorum或Phytophthora syringae，所述共生体系中的细菌为Pandoraea sputorum或Achromobacter insolitus。2.根据权利要求1所述的共生体系，其特征在于：所述共生体系为Phytophthorafragariae var.rubi或Phytophthora cactorum，与Pandoraea sputorum的共生体系；或者，所述共生体系为Phytophthora syringae与Achromobacter insolitus的共生体系。3.根据权利要求1或2所述的共生体系，其特征在于：所述Pandoraea sputorum为Pandoraea sputorum strain CUB2S；所述Achromobacter insolitus为Achromobacter insolitus strain Sn1。4.一种疫霉和细菌共生体系的分析方法，其特征在于：包括分离培养步骤、荧光显微镜和/或透射电镜观察步骤、核酸测序验证步骤；所述分离培养步骤，包括取待分析疫霉样本的菌丝，将其分散于水中，使菌丝破裂，然后进行离心，取上清液涂布于营养琼脂平板上恒温培养至少10h，观察营养琼脂平板上是否存在细菌样有机物；所述荧光显微镜和/或透射电镜观察步骤，包括对存在细菌样有机物的菌丝进行荧光显微镜观察，或者透射电镜观察，进一步确认待分析疫霉样本是否存在共生的细菌；所述核酸测序验证步骤，包括分别提取待分析疫霉样本的菌丝的DNA，以及所述细菌样有机物的DNA，对菌丝的DNA进行ITS和16S rRNA测序，对细菌样有机物的DNA进行16S rRNA测序，通过菌丝的DNA的ITS和16S rRNA测序，进一步验证疫霉和细菌共生体系的存在，对测序结果进行比对，确定待分析疫霉样本中疫霉的具体种或菌株，以及共生系统中细菌的具体种或菌株。5.根据权利要求4所述的分析方法，其特征在于：所述分离培养步骤，还包括在菌丝分散于水中后，用移液枪反复吹打菌丝，使其破裂；优选的，还包括在离心取上清液时，分两轮进行离心，第一轮以不超过500rpm的速度离心不超过5min，获取第一轮离心上清液，然后再对第一轮离心上清液进行第二轮离心，第二轮离心的速度为至少4000rpm，离心时间不少于20min，获得第二轮离心的上清液，分别将第一轮离心上清液和第二轮离心上清液涂布于营养琼脂平板上进行恒温培养；优选的，所述恒温培养的温度为30℃。6.根据权利要求4所述的分析方法，其特征在于：所述荧光显微镜观察包括，将菌丝转移至0.85％的NaCl溶液中，分散均匀后，取混合液于玻片上，加入核酸染料进行染色，然后采用荧光显微镜观察；优选的，加入核酸染料进行染色，具体包括...
【专利技术属性】
技术研发人员：高瑞芳，卢小雨，汪莹，张伟锋，章桂明，王颖，
申请(专利权)人：深圳海关动植物检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：
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