一种薏苡仁玉米赤霉烯酮酶联免疫检测试剂盒和方法技术

本发明专利技术涉及食品毒素残留检测技术领域，公开了一种薏苡仁玉米赤霉烯酮酶联免疫检测试剂盒和方法。所述试剂盒包含辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，以及玉米赤霉烯酮人工抗原。本发明专利技术利用单克隆抗体制备技术，制备ZEN的单克隆抗体，通过方法学考察，进而建立基于薏苡仁中ZEN单克隆抗体的直接竞争酶联免疫分析方法，为薏苡仁中ZEN残留的检测分析提供了一种快速、可靠的技术手段。可靠的技术手段。可靠的技术手段。

【技术实现步骤摘要】
一种薏苡仁玉米赤霉烯酮酶联免疫检测试剂盒和方法


[0001]本专利技术涉及食品毒素残留检测
，具体涉及一种薏苡仁玉米赤霉烯酮酶联免疫检测试剂盒和方法。

技术介绍

[0002]薏苡仁为禾本科植物薏苡Coixlacryma
‑
jobi L.var.ma
‑
yuen(Roman.)Stapf的干燥成熟种仁，药性平和，有利水渗湿、健脾止泻、除痹、排脓、解毒散结之功，《神农本草经》和《本草纲目》均将其列为上品。药食两用的薏苡仁营养及药用价值均较高，近年来食用人群和用量有所增加。薏苡仁在生长、采集、储藏以及加工过程中易被真菌毒素污染，其中玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)检出频率较高。ZEN又称“F
‑
2毒素”，是由黄色镰刀菌(F.culmorum)、禾谷镰刀菌(F.graminearum)、三线镰刀菌(F.tricinctum)等真菌产生的有毒代谢产物，主要存在于谷物中，接触或摄入ZEN会对机体生殖发育、消化系统等造成极大危害，具有潜在的“三致”作用。在《中国药典》(2020年版)中，明确规定了薏苡仁中ZEN的限量要求，每1000g薏苡仁含ZEN不得过500μg。
[0003]中国药典2351真菌毒素测定法中ZEN检测方法为液相色谱法(LC)和液相色谱
‑
串联质谱法(LC
‑
MS)，虽然这些方法可以精确地定性、定量分析，但其检测成本高、周期长，无法满足现场大批量样本快速筛查的需要。近年来，具有高通量、低成本、易于现场化等众多优点的免疫检测技术，已逐渐应用于中药质量控制领域，其中酶联免疫检测方法(enzyme
‑
linked immunosorbent assay，ELISA)已被《中国药典》(2020年版)收录作为黄曲霉毒素的检测方法之一。目前，ELISA已应用于多种中药材的质量检测，如金银花、大黄、马兜铃、葛根、人参、薏苡仁等中药材指标性成分均已建立相应的ELISA检测方法。王文珺、HUANG Y H等研究表明ELISA可用于粮食及饲料中ZEN的残留检测，目前未见中药薏苡仁中ZEN残留ELISA检测的相关报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术以薏苡仁为研究对象，根据该药材的特点对检测试剂和前处理进行合理优化。利用单克隆抗体制备技术，制备ZEN的单克隆抗体，通过方法学考察，进而建立基于薏苡仁中ZEN单克隆抗体的直接竞争酶联免疫分析方法，为薏苡仁中ZEN残留的检测分析提供了一种快速、可靠的技术手段。具体技术方案如下：
[0005]一种人工薏苡仁玉米赤霉烯酮半抗原，具有式I所示的分子结构
[0006][0007]其核磁共振氢谱参数如下：1H
‑
NMR(CDCl3,300MHz)δ：11.0(s,1H,COOH)，8.53(d,2H,ArH)，7.53，7.49(d,2H,ArH)，6.76(s,1H,ArH)，5.89(s,2H,
‑
HC＝CH
‑
)，5.35(s,2H,ArOH)，4.13(m,1H,
‑
O
‑
CH
‑
)，2.79(t,2H,
‑
CH2
‑
)，2.51(t,2H,
‑
CH2
‑
)，2.44
‑
2.47(m,4H,
‑
CH2
‑
C＝O
‑
CH2
‑
)，1.96(t,4H,
‑
CH2
‑
)，1.37(s,3H,
‑
CH3)。
[0008]一种人工薏苡仁玉米赤霉烯酮人工抗原，是通过以下步骤制得：
[0009]合成上述的薏苡仁玉米赤霉烯酮半抗原：取3
‑
(4
‑
氨基苯基)丙酸100mg，加入40μL 1M稀盐酸，再加入1mL蒸馏水稀释溶解，冷却，搅拌，加入亚硝酸钠47mg，搅拌，得到3
‑
(4
‑
氨基苯基)丙酸的重氮盐溶液；取120mg ZEN加乙醇溶解，加入20mg碳酸钾，0℃搅拌，加入重氮盐溶液，搅拌；停止反应，加水，乙酸乙酯萃取，蒸干，上硅胶柱层析，用石油醚
‑
乙酸乙酯混合溶液洗脱分离，得到半抗原产物；
[0010]制备玉米赤霉烯酮人工抗原：取15mg ZEN半抗原，溶解于3mL N,N
‑
二甲基甲酰胺(DMF)中；取30mg 1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐和N
‑
羟基丁二酰亚胺，用1.0mL水充分溶解后加入半抗原溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；分别称取30mg BSA，20mg OVA，使之分别充分溶解在3.0mL PBS缓冲液中；将反应液A等分两份逐滴缓慢滴加到BSA和OVA蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h；用0.01M PBS于4℃透析3d，每天换液3次，离心分装，得到免疫原ZEN
‑
BSA和包被原ZEN
‑
OVAA偶联物。
[0011]一种薏苡仁玉米赤霉烯酮的酶联免疫检测试剂盒，所述试剂盒包含酶标板，辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体；所述酶标板的反应孔中包被有上述的玉米赤霉烯酮人工抗原。
[0012]一种薏苡仁玉米赤霉烯酮的酶联免疫检测试剂盒，所述试剂盒包含辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，以及上述的玉米赤霉烯酮人工抗原。
[0013]优选地，所述试剂盒还包含PBST洗涤液，封闭液。
[0014]一种检测薏苡仁中玉米赤霉烯酮的方法，包括如下步骤：
[0015](1)获取标准曲线：以标准品的0μg
·
kg
‑
1时的OD450nm值为B0值，其他质量浓度的OD450nm值为B值，以标准品质量浓度的对数值为横坐标，百分吸光率值(B/B0
×
100％)为纵坐标，用OriginPro7.5软件绘制标准曲线；
[0016]各质量浓度的标准品的OD450nm测定步骤如下：用包被缓冲液将包被抗原稀释至最佳工作浓度后，包被于酶标板上，100μL每孔，孵育；倾去孔内液体，用PBST洗涤，加入封闭液150μL每孔，孵育；去掉封闭液后，晾干；加入系列浓度的玉米赤霉烯酮标准溶液50μL/每孔，再加入经酶标抗体稀释液稀释至最佳工作浓度的酶标单克隆抗体溶液50μL每孔，25℃避光反应30min；洗涤后加入显色液100μL每孔，25℃显色15min，加入终止液50μL每孔，设定酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值(OD值)；
[0017](2)称取1.0g待测薏苡仁粉末加入5mL 0.02M PBS，再加入5mL甲醇，剧烈振荡5min，4000r
·
min
‑1离心5min，取上清液0.1m本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人工薏苡仁玉米赤霉烯酮半抗原，其特征在于：具有式I所示的分子结构其核磁共振氢谱参数如下：1H
‑
NMR(CDCl3,300MHz)δ：11.0(s,1H,COOH)，8.53(d,2H,ArH)，7.53，7.49(d,2H,ArH)，6.76(s,1H,ArH)，5.89(s,2H,
‑
HC＝CH
‑
)，5.35(s,2H,ArOH)，4.13(m,1H,
‑
O
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CH
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)，2.79(t,2H,
‑
CH2
‑
)，2.51(t,2H,
‑
CH2
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)，2.44
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2.47(m,4H,
‑
CH2
‑
C＝O
‑
CH2
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)，1.96(t,4H,
‑
CH2
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)，1.37(s,3H,
‑
CH3)。2.一种人工薏苡仁玉米赤霉烯酮人工抗原，其特征在于：是通过以下步骤制得：合成权利要求1所述的薏苡仁玉米赤霉烯酮半抗原：取3
‑
(4
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氨基苯基)丙酸100mg，加入40μL 1M稀盐酸，再加入1mL蒸馏水稀释溶解，冷却，搅拌，加入亚硝酸钠47mg，搅拌，得到3
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(4
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氨基苯基)丙酸的重氮盐溶液；取120mg ZEN加乙醇溶解，加入20mg碳酸钾，0℃搅拌，加入重氮盐溶液，搅拌；停止反应，加水，乙酸乙酯萃取，蒸干，上硅胶柱层析，用石油醚
‑
乙酸乙酯混合溶液洗脱分离，得到半抗原产物；制备玉米赤霉烯酮人工抗原：取15mg ZEN半抗原，溶解于3mL N,N
‑
二甲基甲酰胺(DMF)中；取30mg 1
‑
(3
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二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐和N
‑
羟基丁二酰亚胺，用1.0mL水充分溶解后加入半抗原溶液中，室温下搅拌2...

【专利技术属性】
技术研发人员：南铁贵，袁媛，赵玉洋，詹志来，康利平，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：