一种利用化学交联制备纯化泛素化或类泛素化组蛋白八聚体的方法技术

本发明专利技术公开一种利用化学交联制备纯化泛素化或类泛素化组蛋白八聚体的方法，包括以下步骤：(1)表达纯化得到突变型泛素或类泛素蛋白；所述突变型泛素的C末端为半胱氨酸，所述突变型类泛素蛋白的C末端甘氨酸对应的核苷酸序列突变为半胱氨酸对应的核苷酸序列；(2)表达纯化得到突变型的组蛋白八聚体；所述突变型的组蛋白八聚体在进行泛素化/类泛素化修饰位点上的赖氨酸突变为半胱氨酸；(3)利用化学交联剂，将突变型泛素或类泛素蛋白与突变型组蛋白八聚体在非变性条件下进行交联反应；(4)将化学交联反应产物进行标准色谱纯化。该方法利用化学交联方法直接在组蛋白八聚体水平上进行体外构建泛素化/类泛素化组蛋白八聚体。体外构建泛素化/类泛素化组蛋白八聚体。

【技术实现步骤摘要】
一种利用化学交联制备纯化泛素化或类泛素化组蛋白八聚体的方法


[0001]本专利技术涉及体外构建泛素化或类泛素化组蛋白八聚体，具体涉及一种利用化学交联制备纯化泛素化或类泛素化组蛋白八聚体的方法。

技术介绍

[0002]染色体是真核生物中携带遗传信息的主要载体，其基本结构单元是核小体。核小体由四种组蛋白(H2A、H2B、H3和H4)构成的八聚体和缠绕上面的147bp的DNA组成，核小体之间由linker DNA连接形成串珠状结构，经过多步压缩折叠形成染色体。表观遗传调控是一种不改变DNA序列的情况下，发生的基因表达可遗传的变化，主要包括DNA甲基化、X染色体失活、染色质重塑、组蛋白修饰等。
[0003]组蛋白修饰是非常重要的表观遗传调控之一，主要包括甲基化、磷酸化、乙酰化、乙酸化、sumo化和泛素化等。其中泛素化修饰占组蛋白修饰的16％左右，是组蛋白修饰中非常重要的一种翻译后修饰，其通过改变染色质结构或招募组蛋白修饰因子来影响基因表达。组蛋白的泛素化和去泛素化是基于组蛋白修饰的基因表观遗传调控的基质之一，它和组蛋白的其他修饰共同形成了“组蛋白密码”，目前已经成为基因转录调控的研究热点。越来越多的研究表明组蛋白的泛素化修饰不仅与基础生命活动息息相关，而且影响多种疾病的发生发展，因此研究与疾病相关的组蛋白泛素化修饰可以作为一种潜在的治疗疾病的靶点。基于泛素化组蛋白的合成、核小体复合物方法的开展以及冷冻电镜技术的出现，近些年研究者对一系列重要的泛素化核小体与效应蛋白复合物展开了研究，揭示分析了泛素化核小体对部分效应蛋白的特异性识别与活化机制。然而，目前获得泛素化核小体的底物(泛素化组蛋白八聚体)具有一定的难度和挑战，因此亟需一种简单高效的方法来解决上述问题。
[0004]目前获得泛素化核小体的方法主要有两种，一种是分离纯化内源性核小体(Hela细胞或小牛胸腺)，但是该方法具有以下比较明显的缺点：1、由于生物体的复杂性导致分离的核小体修饰类型不均一；2、纯化过程中被裂解液中的去泛素化酶影响，可能导致核小体去泛素化。另一种比较经典的是体外重组核小体的方法，首先在变性条件下(尿素和盐酸胍)分别纯化出四种组蛋白(H2A、H2B、H3和H4)，然后通过透析复性方法折叠成组蛋白八聚体，再与DNA混合后通过透析降低盐浓度的方法获得体外重组的核小体，这种方法最大的限制是步骤多、耗时长。而对于泛素化核小体复合物的研究中，需要获得泛素化的组蛋白八聚体，为了解决这个问题，相关科研工作者开展了全化学合成、半化学合成以及化学交联方法。其中，全合成需要利用固相合成的方法合成若干个比较短的多肽链，再用化学键将这些多肽链连接成一条完整的目标蛋白；半化学合成是一种将多种表达重组蛋白通过化学键连接起来形成目标蛋白的方法，上述两种方法都存在操作繁琐、难度大、产率低的问题。应运而生的化学交联方法巧妙的解决了上述问题，不仅操作简单、产率较高，而且获得的泛素化组蛋白对去泛素酶不敏感，化学性质稳定，适合泛素化核小体复合物的结构观察和相关研究。
[0005]现有的获得泛素化组蛋白的化学交联方法包括以下步骤：(1)通过分子克隆技术在泛素的N端加上His标签，将泛素的C末端甘氨酸突变为半胱氨酸，表达纯化出突变的泛素；(2)将组蛋白的特定位点的赖氨酸突变为半胱氨酸，表达纯化出突变的组蛋白；(3)将上述两种蛋白溶解于10mM HCl中，在交联剂二氯丙酮的作用下，以及在50mM硼酸缓冲液，pH 8.1条件下进行交联反应，完成组蛋白的泛素化修饰；(4)将交联反应产物重悬到含尿素的缓冲液中通过镍柱或钴柱纯化得到泛素化组蛋白、泛素的二聚体和未反应的泛素，同时未参与反应的组蛋白从流穿液中除去；(5)然后用TEV酶切过夜(切除His标签)，再次通过镍柱或钴柱纯化收集泛素化组蛋白、泛素二聚体和未反应的泛素，透析后冻干；(6)接下来将冻干的蛋白重悬到含尿素的缓冲液中，通过半制备反相高效液相色谱柱得到泛素化的组蛋白，透析后冻干；(7)然后通过标准流程获得泛素化组蛋白八聚体，具体步骤如下：将四种冻干的组蛋白按比例重悬到含盐酸胍的unfolding buffer中，然后透析到含有2M NaCl或KCl的refolding buffer复性成组蛋白八聚体；(8)最后通过凝胶过滤层析纯化分离得到泛素化组蛋白八聚体。
[0006]然而，上述方法仍存在以下缺点：步骤多、耗时长、操作繁琐，最后通过凝胶过滤层析得到的泛素化组蛋白八聚体纯度不高，如图1所示(图1引自Dyer,P.N.,Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA.Methods Enzymol 2004,375,23
‑
44)，H3
‑
H4四聚体与组蛋白八聚体无法完全分离。
[0007]而且，对于上述方法而言，分别表达的组蛋白属于包涵体形式(非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性)的蛋白，因此必须在变性条件下进行交联、纯化，具体为在交联反应中加入HCl以及在纯化过程中添加尿素和盐酸胍以增加组蛋白的溶解性；而且，由于组蛋白需要进一步复性重折叠成正确的三级结构才能具有生物活性；所以，该方法会有导致组蛋白损伤、从而影响其生物活性的风险。
[0008]此外，组蛋白纯化过程中需要多步透析置换缓冲液条件，这一方面增加了纯化时间，另一方面蛋白长期在变性条件中会增加损伤蛋白质的风险。
[0009]因此亟需一种快速、高效获得泛素化/类泛素化核小体底物(泛素化/类泛素化组蛋白八聚体)的方法，进而揭示更多与疾病发生相关的分子机制，推动表观遗传领域的研究进展。

技术实现思路

[0010]为了克服现有技术的缺陷与不足，本专利技术的目的在于提供一种利用化学交联制备纯化泛素化或类泛素化组蛋白八聚体的方法，该方法利用化学交联方法直接在组蛋白八聚体水平上进行体外构建泛素化/类泛素化组蛋白八聚体。
[0011]本专利技术的目的通过以下技术方案实现：
[0012]一种利用化学交联制备纯化泛素化或类泛素化组蛋白八聚体的方法，包括以下步骤：
[0013](1)通过大肠杆菌感受态细胞表达纯化得到突变型泛素或类泛素蛋白；所述突变型泛素的C末端为半胱氨酸，所述突变型类泛素蛋白的C末端甘氨酸对应的核苷酸序列突变为半胱氨酸对应的核苷酸序列，以用于与组蛋白八聚体进行交联反应；
[0014](2)通过大肠杆菌感受态细胞表达纯化得到突变型的组蛋白八聚体；所述突变型
的组蛋白八聚体在进行泛素化/类泛素化修饰位点上的赖氨酸突变为半胱氨酸；
[0015](3)利用化学交联剂，将突变型泛素或类泛素蛋白与突变型组蛋白八聚体在非变性条件下进行交联反应；
[0016](4)将化学交联反应产物进行标准色谱纯化，即可得到高纯度的泛素化或类泛素化组蛋白八聚体。
[0017]本专利技术根据生物体内泛素化修饰的过程，将泛素或类泛素蛋白C末端的甘氨酸突变为半胱氨酸，组蛋白八聚体在需要进行泛素化/类泛素化修本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用化学交联制备纯化泛素化或类泛素化组蛋白八聚体的方法，其特征是，包括以下步骤：(1)通过大肠杆菌感受态细胞表达纯化得到突变型泛素或类泛素蛋白；所述突变型泛素的C末端为半胱氨酸，所述突变型类泛素蛋白的C末端甘氨酸对应的核苷酸序列突变为半胱氨酸对应的核苷酸序列；(2)通过大肠杆菌感受态细胞表达纯化得到突变型的组蛋白八聚体；所述突变型的组蛋白八聚体在进行泛素化/类泛素化修饰位点上的赖氨酸突变为半胱氨酸；(3)利用化学交联剂，将突变型泛素或类泛素蛋白与突变型组蛋白八聚体在非变性条件下进行交联反应；(4)将化学交联反应产物进行标准色谱纯化，即可得到高纯度的泛素化或类泛素化组蛋白八聚体。2.根据权利要求1所述利用化学交联制备纯化泛素化或类泛素化组蛋白八聚体的方法，其特征是，所述步骤(3)中交联反应的具体步骤如下：将突变型泛素或类泛素蛋白和组蛋白八聚体在冰浴条件下混合均匀，再加入化学交联剂，以PBS作为缓冲液，在冰浴条件下进行交联反应，反应结束后加入还原剂终止反应，即得交联反应产物；所述化学交联剂是二氯丙酮或二溴丙酮。3.根据权利要求2所述利用化学交联制备纯化泛素化或类泛素化组蛋白八聚体的方法，其特征是，所述交联反应中，组蛋白八聚体、突变型泛素或类泛素蛋白和化学交联剂的摩尔比为1∶2～16∶2～32。4.根据权利要求3所述利用化学交联制备纯化泛素化或类泛素化组蛋白八聚体的方法，其特征是，所述交联反应在1.5～2.5M氯盐的环境下进行；所述氯盐的阳离...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯宇驰，李维捷，徐朋奇，张影，何俊，
申请(专利权)人：深圳粒影生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：