一种表达GLP-1和胰岛素缀合物多肽的重组工程菌制造技术

本发明专利技术涉及一种表达GLP

【技术实现步骤摘要】
一种表达GLP
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1和胰岛素缀合物多肽的重组工程菌


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别涉及一种表达GLP
‑
1和胰岛素缀合物多肽的重组工程菌。

技术介绍

[0002]糖尿病是一种因胰岛素绝对或相对分泌不足和/或胰岛素利用障碍引起的碳水化合物、蛋白质、脂肪等代谢紊乱性疾病，以高血糖为主要标志，可由遗传和环境等多种因素引起。糖尿病是人类三大致死疾病之一，它的死亡率仅次于心脑血管疾病和癌症。
[0003]胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成，外源性胰岛素及胰岛素衍生物主要用来治疗糖尿病。胰岛素由A、B两个肽链组成，人胰岛素(Insulin Human)A链有11种21个氨基酸，B链有15种30个氨基酸，共51个氨基酸；其中A7(Cys)
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B7(Cys)、A20(Cys)
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B19(Cys)四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使A、B两链连接起来，此外A链中A6(Cys)与A11(Cys)之间也存在一个二硫键。胰岛素由胰脏内的胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌。胰岛素在细胞水平的生物作用是通过与靶细胞膜上的特异受体结合而启动的；胰岛素受体为胰岛素起作用的靶细胞膜上特定部位，仅可与胰岛素或含有胰岛素分子的胰岛素原结合，具有高度的特异性。
[0004]胰岛素虽然是治疗糖尿病最有效的手段，但长期使用胰岛素也会存在一些副作用，比如引起肥胖。胰岛素除了能够调节体内糖代谢，还具备调节脂肪代谢的作用：胰岛素能够促进脂肪的合成与贮存，使血液中游离脂肪酸减少，同时抑制脂肪的分解氧化。这也是为什么会引发体重增加，尤其是腹部脂肪增加的原因。此外，胰岛素使用还存在一定的低血糖风险。
[0005]胰高血糖素样肽1(GLP
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1)是一种由肠道L细胞分泌的促胰素，具有促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素的释放、刺激胰岛β细胞增殖、诱导胰岛β细胞再生、阻止胰岛β细胞凋亡、改善胰岛素敏感性和增加葡萄糖的利用等作用。因此，GLP
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1及其类似物和衍生物在治疗I和II型糖尿病的发生、发展中起着重要作用。GLP
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1类似物和胰高血糖素的氨基酸序列有近一半相同，同样具有葡萄糖依赖性的促胰岛素分泌和生物合成、抑制胰高血糖素分泌及抑制胃排空等多种功能，同时，GLP
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1作为一种肠源性激素，其是在营养物质(特别是碳水化合物)的刺激下才释放入血的，其促胰岛素分泌作用呈葡萄糖浓度依赖性，能够在血糖升高时发挥降糖作用，抑制胰高糖素分泌，增加饱腹感，减少饥饿感，从而达到降低血糖作用。此外，GLP
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1还可作用于中枢神经系统(特别是下丘脑)抑制食欲，减少进食量，从而使人体产生饱胀感和食欲下降，减少卡路里的摄入量。因此，GLP
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1及其类似物优点在于其不仅能够有效降低血糖，且能够降低体重、调节血压血脂、使心血管获益、无低血糖风险。
[0006]胰岛素能够与胰岛素受体结合，GLP
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1能够激活GLP
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1受体，因此，若将胰岛素和GLP
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1进行缀合修饰，则缀合物可以同时对胰岛素受体和GLP
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1受体具有激动活性，兼备两者作用，有效调节血糖的情况下，降低低血糖风险，调节体重增加，并对心血管获益有所帮
助。并且，GLP
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1和胰岛素联用，能够使缀合物靶向至下丘脑，以降低食欲以及减少血液中葡萄糖浓度。另外，GLP
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1和胰岛素缀合物可以靶向至β细胞以驱动增加胰岛β细胞生产胰岛素。
[0007]目前，对GLP
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1和胰岛素缀合物的研究较少，关于其重组表达载体及其重组工程菌的研究则更少。而在确定GLP
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1和胰岛素缀合物结构后，制备具有高表达能力的重组工程菌及研发其高表达发酵方法，能够提高单位体积的GLP
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1和胰岛素缀合物多肽表达量，显著降低原料生产成本，极大降低药物价格，产品上市后对企业、对患者均有重大意义。本专利技术目的正是提供一种具有高表达GLP
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1和胰岛素缀合物多肽的重组工程菌，并探索其高密度发酵方法。

技术实现思路

[0008]定义
[0009]本专利技术的术语“胰岛素”包括天然存在的胰岛素，例如人胰岛素，以及其胰岛素类似物。人胰岛素由两个多肽链组成，分别被称为人胰岛素A链和人胰岛素B链。
[0010]本专利技术中术语“GLP
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1类似物”是指对人天然GLP
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1氨基酸进行修饰获得的多肽，所述修饰包括去除和/或取代(置换)和/或添加(延长)一个或多个氨基酸残基，所述氨基酸可以是天然存在的氨基酸，也可以是人工合成的氨基酸。
[0011]本专利技术中，有关肽(例如GLP
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1或胰岛素)的术语“衍生物”表示经化学修饰(如共价修饰等)的肽或其类似物。典型的修饰是酰胺、糖类、烷基、酰基、酯等。
[0012]本专利技术中，术语“载体”是指可以将编码蛋白质或多肽的核苷酸片段可操作地插入其中以引起所述蛋白质或多肽表达的媒介物。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，以使其在宿主细胞内表达携带的遗传元件。载体的实例包括质粒、人工染色体、噬菌体、病毒颗粒等。载体可以含有多种用于控制表达的元件，包含启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件和报告基因。载体还可以包括有助于其进入细胞的材料，包括但不限于病毒颗粒、脂质体或蛋白质包膜。
[0013]载体可以是重组表达载体或克隆载体。本专利技术提供了载体(例如表达载体)，其含有编码所述胰岛素和GLP
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1缀合物的本专利技术提供的核酸序列。载体的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒、乳多空病毒(例如SV40)、λ噬菌体和M13噬菌体、质粒，如pcDNA3.3、pMD18
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T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD
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Hyg
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GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV
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L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV
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SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR2.1、pEF
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1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF
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Bos等。
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种包含GLP
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1和胰岛素缀合物多肽的融合多肽，其特征在于，所述融合多肽由促包涵体序列、酶切序列和GLP
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1和胰岛素缀合物多肽序列依次串联组成，其序列如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示。2.一种编码权利要求1所述融合多肽的多核苷酸片段。3.根据权利要求2所述的多核苷酸片段，其特征在于，所述多核苷酸片段的序列选自SEQ ID NO:9
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16中的任意一项。4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求2或3所述的多核苷酸片段。5.一种表达GLP
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1和胰岛素缀合物多肽的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌包含权利要求4所述的重组表达载体。6.根据权利要求5所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组表达载体为重组pET
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30a(+)表达载体，所述重组工程菌为重组BL21大肠杆菌工程菌。7.根据权利要求6所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌按照如下方法构建：(1)合成权利要求2或3所述的多核苷酸片段；(2)将步骤(1)合成的多核苷酸片段连接至表达载体pET
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30a(+)中，构建得到重组表达载体；(3)将步骤(2)构建的重组表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹海燕，林兆生，连婕妮，王惠，王冠，王丽军，
申请(专利权)人：吉林惠升生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：