一种融合蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种融合蛋白，基于该融合蛋白的编码多核苷酸、表达载体、工程菌和应用。本发明专利技术的融合蛋白至少由引导肽、促表达肽、酶切位点片段和胰岛素前体依次连接而成，促表达肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。基于本发明专利技术的融合蛋白构建的重组工程菌可以显著提高融合蛋白在大肠杆菌中表达量，从而实现长效酰化胰岛素衍生物的产业化生产应用，商业应用前景广阔。同时，基于本发明专利技术的充足工程菌，提出一种制备长效酰化胰岛素衍生物的方法，制备得到的长效酰化胰岛素衍生物具备一周使用一次的潜力，且降糖效果显著。著。

【技术实现步骤摘要】
一种融合蛋白及其应用
[0001]本申请要求2022年7月4日提交的申请号为202210788609.4的专利申请的全部优先权。该申请的全部内容全部以引用方式并入本文。


[0002]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种融合蛋白，基于该融合蛋白的多核苷酸、表达载体、工程菌及应用。

技术介绍

[0003]随着社会经济的发展，人民生活水平逐步提高，人们的饮食结构发生了巨大变化，也导致肥胖发生率增加，并进一步导致糖尿病患者人数的急剧增加。
[0004]糖尿病是由遗传和环境因素长期相互作用导致的复杂的慢性代谢性疾病，是由于胰岛素分泌缺乏导致，以高血糖为特征的疾病，分为I型糖尿病和II型糖尿病，其中II型糖尿病(T2DM)在我国糖尿病患者中占到了95％以上的比例。
[0005]而治疗糖尿病最主要的药物就是胰岛素及其衍生物、胰高血糖素样肽
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1(glucagon
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likepeptide
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1，GLP
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1)受体激动剂(GLP
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1RAs)及其相关多靶点共激动剂。上述药物均为蛋白或多肽类药物。
[0006]目前已公开了一系列在天然人胰岛素序列的不同位点上有氨基酸取代的胰岛素类似物的专利申请。EP0425482B1公开了一种在B25位上有His或Tyr取代的胰岛素类似物。EP0419504B1公开了一种在B3有取代，同时在A5或A15有Gln取代，或在A18或A21有Asn取代的胰岛素类似物。US5008241A公开了一种在A21有特定氨基酸取代，同时在A4、A17、B13或B21有特定氨基酸取代的胰岛素类似物。US5164366A公开了在B24、B25、B26或B27位其中有一位缺失的胰岛素类似物。CN1195777C公开了在A8、A9、A10、B30上有取代的胰岛素类似物。US7193035B2公开了在B3和至少在B27、B28或B29中的一位有取代的胰岛素类似物晶型。CN1780854公开了一种A0(Arg)A21(Gly)B31(Arg)B32(Arg)胰岛素类似物。
[0007]通常，胰岛素制剂是通过皮下注射给药的。然而，长期的注射会给患者带来很大痛苦，因此，人们希望可以通过延长胰岛素的降糖效果，以减少注射的次数，减少患者的痛苦。
[0008]Icodec胰岛素是一种在研的长效基础胰岛素类似物，其分子设计为去除胰岛素的B30，同时引入若干个氨基酸突变：A14E、B16H、B25H。并在B29K连接一个C
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的脂肪酸链。相对于地特胰岛素和德谷胰岛素，Icodec具备更长半衰期。A14E、B16H、B25H突变目的在于减少酶切降解，同时减弱与肤岛素受体(IR)的亲和力，减少IR介导的清除，进一步延长半衰期。在注射进人体后，Icodec胰岛素会与白蛋白紧密但可逆的结合在一起。这一结果可在一周时间内连续、缓慢且稳定地降低血糖。基于其浓缩配方，每周注射一次的Icodec胰岛素用量与每日注射一次的甘精胰岛素U100相当，从而可以实现一周一次给药。
[0009]目前采用基因工程表达人胰岛素及其类似物早已成为工业主流手段。基因工程中表达胰岛素的微生物主要分为2类，分别是大肠杆菌及酵母菌。对于原核基因表达系统，使用最多的即为大肠杆菌(Escherichiacoli)来作为宿主菌，这也是目前应用最广泛的蛋白
表达系统。原因是大肠杆菌表达系统遗传背景和生理特性研究清楚，已开发有多种商业化工程菌可以使用；且大肠杆菌易于培养和控制、转化操作简单，并具有表达水平高、成本低、周期短等特点。对于应用原核系统表达外源基因时，大多研究利用融合蛋白表达方式，将各种不同的引导肽序列融合到目的基因上，形成重组融合蛋白。在大肠杆菌中表达时，引导肽可以将目的蛋白分泌到细胞周质甚至细胞外，最后，通过蛋白酶等将引导肽切除去。但是，对于部分具备特殊结构或氨基酸序列组成的多肽，如胰岛素前体，其往往难以表达或表达量低，无法满足商业化使用需求。为此，有时需要一些其他方案，进一步增加其表达量，例如通过增加一段促表达肽，促表达肽连接于引导肽之后，能够显著增强融合蛋白表达量，并通过酶切等处理后得到目的蛋白片段。对于能够进一步增强上述蛋白或多肽高表达的促表达肽及使用促表达肽构建的具备高表达潜力的表达载体及其重组工程菌研究较少。
[0010]本专利技术申请人构建了一系列长效且降糖效果优于Icodec的胰岛素衍生物。由于结构特殊性(存在较多GQAP重复序列)，上述胰岛素衍生物的多肽发酵表达和生产存在诸多困难。为了克服表达量低，生产成本高的问题，申请人开展了大量对表达体系的研究工作，得到一种适用于所述胰岛素衍生物的多肽前体表达的融合蛋白及表达体系。

技术实现思路

[0011]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种长效酰化胰岛素衍生物的融合蛋白，其多核苷酸、表达载体和工程菌。
[0012]如本文所用，术语“引导肽”是指连接于目标多肽或蛋白，引导蛋白可溶表达、分泌，或帮助目标多肽或蛋白正确折叠实现可溶表达的多肽序列，也称为“前导肽”、“先导肽”、“分泌肽”。
[0013]如本文所用，术语“促表达肽”是指连接在引导肽后或目的蛋白或多肽前，进一步增强目的蛋白或多肽表达量，或能够促进难以通过常规引导肽表达的目的蛋白或多肽的表达的多肽序列。
[0014]术语“肽”是指包括通过肽键连接的氨基酸序列的分子，无论长度、翻译后修饰或功能。
[0015]如本文所用，术语“胰岛素”是指为51个氨基酸残基多肽(5808道尔顿)的激素，其在许多关键细胞过程中起重要作用。人胰岛素的成熟形式由51个氨基酸组成，排列成总分子量为5808Da的A链(GlyAl
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AsnA21)和B链(PheB1
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ThrB30)。该分子通过两个链间(A20
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B19，A7
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B7)和一个链内二硫键(A6
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A11)稳定。本专利技术的胰岛素包括天然的、通过合成提供的或基因工程化的(例如重组的)来源，在本专利技术的各种实施方式中，胰岛素可以是人胰岛素。
[0016]如本文所用，术语“胰岛素类似物”是指胰岛素的改变形式，其是胰岛素的更快速作用形式或更均匀作用形式。这样的类似物的非限制性实例是赖脯胰岛素、德谷胰岛素(Insulin Degludec)、门冬胰岛素(Insulin Aspart)和甘精胰岛素。“赖脯”胰岛素类似物在初级结构上与人胰岛素相同，通过交换B28位置处的赖氨酸和B29位置处的脯氨酸而不同于人胰岛素。它是一种短效胰岛素单体类似物。“甘精”胰岛素类似物通过在A21处用天冬酰胺替换甘氨酸，以及在B链的C末端添加两个精氨酸残基而不同于人胰岛素。在pH4.0下配制和注射甘精胰岛素溶液。这些修饰将等电点提高至更中性的pH，降低了生理条件下的溶解
度，并且导致甘精胰岛素在注射位置沉淀，从而减慢了吸收。甘精胰岛素是一种持续20～24小时的长效类似物。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白至少由引导肽、促表达肽、酶切位点片段和胰岛素前体依次连接而成，所述促表达肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述酶切位点的氨基酸序列选自K或SEQ ID NO.10；所述胰岛素前体由经修饰的胰岛素A链和经修饰的胰岛素B链经C肽连接而成；所述经修饰的胰岛素A链的氨基酸序列选自SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；所述经修饰的胰岛素B链的氨基酸序列选自SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述C肽选自如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列的多肽。3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述引导肽选自如SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列的多肽。4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，经修饰的胰岛素A链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，经修饰的胰岛素B链的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；或，经修饰的胰岛素A链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，经修饰的胰岛素B链的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；或，经修饰的胰岛素A链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，经修饰的胰岛素B链的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；或，经修饰的胰岛素A链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，经修饰的胰岛素B链的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。5.根据权利要求1～4任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.14。6.一种用于编码权利要求1～5任一项所述融合蛋白的多核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹海燕，林兆生，刘伟华，王惠，尤冬超，王娟，
申请(专利权)人：吉林惠升生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：