【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，尤其涉及一种提高外源蛋白表达量的方法。
技术介绍
1、外源蛋白表达面临表达量低、纯度低和功能性差等问题。在真核生物中，过表达外源蛋白可能造成内质网内聚集大量的未折叠蛋白，超越内质网的加工能力，导致蛋白容易发生错误折叠，从而限制其高水平表达。
2、目前提高蛋白质表达量的宏观方法包括有改造分泌信号肽、启动子工程、提高胞内拷贝数、共表达分子伴侣等，微观方法包括有crispri干扰技术等。
3、在真核系统中，重组蛋白从转录到翻译的调控较为复杂，而通过优化mrna二级结构带来翻译效率的提升是一种优化微生物表达蛋白的策略。
技术实现思路
1、目前最为有效的方法是通过翻译暂停技术达到减缓蛋白质翻译速率，从而提升表达量的方法，本专利技术旨在通过引入少量的碱基找到适合目的蛋白的n端的前导肽，起到与翻译暂停技术相类似的效果。
2、本专利技术的技术原理：首先，将重组蛋白n端前多个碱基序列转换为rna序列作为输入信号，使用mfold软件进行rna二级结构预测，然后在蛋白序列的n端引入不同种类及个数的的氨基酸，专利技术人发现引入两个组氨酸能够增强rna二级结构稳定性，起到减缓蛋白质翻译速率的作用，从而使得肽链能够更好地折叠形成目的蛋白，后面通过sds-page实验也证实了该方法能够提高外源蛋白在毕赤酵母中产量。
3、本专利技术的第一目的在于提供一种提高外源蛋白表达量的方法，在编码外源蛋白的核苷酸序列的5’端添加编码连续两个组氨酸的核苷酸进行
4、优选地，所述的表达是在毕赤酵母中表达。
5、优选地，所述的外源蛋白为胶原蛋白；更优选地，所述的外源蛋白为重组胶原蛋白。
6、优选地，包括以下步骤：
7、i）将目的片段通过克隆组装至载体质粒上，转化至大肠杆菌中扩增，抽提质粒；
8、ii）用快切酶对质粒进行线性化，电转化至毕赤酵母，使用ypd抗性平板进行初筛和复筛；
9、iii）将转化子挑取至bmgy培养基中，培养后离心弃上清；使用bmmy培养基将菌体重悬，诱导培养；培养液经分离纯化得到目的蛋白。
10、更优选地，所述的载体质粒为ppiczαa，所述的大肠杆菌为大肠杆菌jm109，所述的快切酶为酶saci，所述的毕赤酵母为毕赤酵母gs115。
11、更优选地，使用ypd抗性平板进行初筛和复筛是指使用100μg/ml的ypd抗性平板进行初步筛选，800μg/ml的ypd抗性平板进行复筛。
12、更优选地，所述的诱导培养是使用1%的甲醇，每24小时补加一次，共计诱导培养96小时。
13、本专利技术第二个目的是提供高表达的重组胶原蛋白，其氨基酸序列与seq id no.1或2所示的氨基酸序列有90%以上同源性。
14、优选地，其氨基酸序列如seq id no.1或2所示。
15、关于氨基酸序列同源性，一方面是基于保守氨基酸取代，这种保守性使得某氨基酸被结构相似的氨基酸取代而不会对所得变体多肽的性质产生大的影响，例如是被具有相似侧链的氨基酸残基取代。另一方面，本专利技术考虑到在seq id no.1或seq id no.2基础上增添一段或多段冗余序列，而这种改变未带来生物活性明显增加的现象，即原来的生物活性片段不会因为冗余序列的介入而更好地发挥生物功能。
16、本专利技术提供了编码所述的高表达的重组胶原蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列与seq id no.3或seq id no.4的核苷酸序列有80%以上同源性；优选地，所述基因的核苷酸序列与seq id no.3或seq id no.4的核苷酸序列有90%以上同源性；最优选地，所述基因的核苷酸序列如seq id no.3或seq id no.4所示。
17、关于核苷酸序列同源性，一方面是由于存在密码子的简并性，导致编码蛋白的核苷酸序列并不唯一，因此能够编码产生如seq id no.1或seq id no.2所示的氨基酸序列的核苷酸序列，均在本专利技术的保护范围内。另一方面，如前述的氨基酸序列同源性，相应地编码与seq id no.1或seq id no.2具有同源性90%的氨基酸序列的核苷酸序列，也落在本专利技术的保护范围内。
18、本专利技术的第三个目的是提供两个组氨酸组成的标签在促进外源蛋白表达中的应用。
19、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
20、本专利技术通过在目的蛋白的n端引入两个组氨酸，使得蛋白的表达量得到了显著提高，实验结果显示提高了5倍以上；相比于其它技术，本专利技术方法操作更简便，并且维持了外源蛋白的理化性质如蛋白质的高级结构和生物活性。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种提高外源蛋白表达量的方法，其特征在于，是在编码外源蛋白的核苷酸序列的5’端添加编码两个组氨酸的核苷酸进行表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表达是在毕赤酵母中表达。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的外源蛋白为胶原蛋白。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的载体质粒为pPICZαA，所述的大肠杆菌为大肠杆菌JM109，所述的快切酶为酶SacI，所述的毕赤酵母为毕赤酵母GS115。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，使用YPD抗性平板进行初筛和复筛是指使用100μg/mL的YPD抗性平板进行初步筛选，800μg/mL的YPD抗性平板进行复筛。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的诱导培养是使用1%的甲醇，每24小时补加一次，共计诱导培养96小时。
8.一种高表达的重组胶原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1或2所示。
9.编码权利要求8所述
10.两个组氨酸组成的标签在促进外源蛋白表达中的应用，其特征在于，是在外源蛋白的氨基酸序列的N端添加两个组氨酸。
...【技术特征摘要】
1.一种提高外源蛋白表达量的方法，其特征在于，是在编码外源蛋白的核苷酸序列的5’端添加编码两个组氨酸的核苷酸进行表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表达是在毕赤酵母中表达。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的外源蛋白为胶原蛋白。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的载体质粒为ppiczαa，所述的大肠杆菌为大肠杆菌jm109，所述的快切酶为酶saci，所述的毕赤酵母为毕赤酵母gs115。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，使用y...
【专利技术属性】
技术研发人员：石竟成，宋晓慧，李艳，孙耀玺，张影，葛建敬，
申请(专利权)人：深圳粒影生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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