丁酸梭菌在结直肠癌辅助治疗上的应用制造技术

本发明专利技术公开了丁酸梭菌在结直肠癌辅助治疗上的应用。在本发明专利技术中，证明了C.B通过调节包括MYC在内的关键信号分子，对CRC中的增殖、迁移、干细胞和肿瘤生长进行了重新编程，通过补充C.B可使MYC失去稳定，抑制癌细胞增殖/转移，提高5

【技术实现步骤摘要】
丁酸梭菌在结直肠癌辅助治疗上的应用


[0001]本专利技术涉及微生物功能
，特别是指丁酸梭菌在结直肠癌辅助治疗上的应用。

技术介绍

[0002]结直肠癌(colorectal cancer,CRC)，是人类常见的恶性肿瘤，目前被列为世界第三大癌症。随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变，其发病率和死亡率呈上升趋势，严重威胁着人类的健康。已有大量研究报道CRC与多种因素有关，如肥胖、糖尿病、久坐生活方式、高脂肪饮食、吸烟、酗酒、年龄、性别、家族史等，但其确切的发病机制仍不明确。
[0003]有文献报道在结肠癌中肠道菌群的组成发生了变化，提示肠道菌群生态失衡在结直肠癌发生发展中发挥着重要作用。因此，越来越多的研究表明，益生菌的使用可以对抗CRC患者肠道菌群的失调，从而恢复疾病导致的肠菌生态失衡，减少细菌引起的炎症、遗传毒性、致癌途径等。
[0004]目前的研究都停留在丁酸梭菌作为益生菌在一些疾病和癌症的发生发展中有相应的调节作用，但这些调节作用所涉及的机制在很大程度上仍未被探索清楚。因此，对丁酸梭菌的作用机制进行深入挖掘，可以进一步扩大丁酸梭菌在结直肠癌治疗上的应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术是基于丁酸梭菌对结直肠癌的作用机制的基础上，深入探索其更多的应用可能，提高丁酸梭菌的应用方向。
[0006]本专利技术的研究方向如下：
[0007]1、通过细胞增殖、克隆形成、结直肠癌类器官的培养，细胞迁移侵袭、流氏细胞术，肺转移裸鼠模型等实验探究C.B CM对结直肠癌细胞的生物学行为的影响。
[0008]2、转录组学测序显示C.B CM可影响细胞周期导致细胞周期停滞，应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT
‑
PCR)、免疫印迹(Western blot，WB)以及流氏细胞等的方法可验证其对细胞周期相关基因和蛋白的影响。运用泛素化实验和蛋白降解速率的方法研究C.B CM对细胞周期相关蛋白MYC的调控作用。
[0009]3、TCGA数据库分析可得MYC可正向调控TYMS，构建沉默或过表达MYC的结直肠癌细胞株，通过qRT
‑
PCR及WB验证其沉默或过表达时TYMS也会有同样的下调和上调的状况。通过qRT
‑
PCR及ChIP实验验证在处理过C.B CM后，MYC与TYMS该启动子区域的结合减弱。IC50、细胞凋亡、克隆形成实验表明C.B CM可能增强5
‑
FU的敏感性。
[0010]4、裸鼠皮下成瘤实验，是否C.B CM能够增强5
‑
FU对HCT116细胞在裸鼠体内的成瘤抑制的能力。免疫组化(Immunohistology，IHC)验证肿瘤增殖凋亡以及MYC和TYMS的表达情况。
[0011]5、C57BL/6J小鼠皮下成瘤实验，观察C.B和C.B CM本身是否可以抑制小鼠皮下成瘤，是否可以上调免疫相关蛋白的表达，联合使用anti
‑
PD1同样能够提高anti
‑
PD1对
HCT116细胞在裸鼠体内的成瘤抑制的能力。免疫组化(Immunohistology，IHC)验证MYC等免疫标识相关蛋白的表达情况。
[0012]在本专利技术中，证明了丁酸梭菌通过调节包括MYC在内的关键信号分子，对CRC中的增殖、迁移、干细胞和肿瘤生长进行了重新编程，通过补充C.B可使MYC失去稳定，抑制癌细胞增殖/转移，提高5
‑
FU的治疗敏感性，以及增强anti
‑
PD1免疫治疗的应答。MYC是胸苷酸合成酶(TYMS)的转录因子，而TYMS是5
‑
FU的关键耐药靶点。此外，已知MYC对PD
‑
1表达有影响。从机制上讲，C.B抑制CRC细胞通过增强泛素介导的泛素化，导致MYC降解，从而减轻MYC介导的5
‑
FU耐药性，提高抗PD1免疫治疗效果。总之，本专利技术揭示了以前未被认可的C.B和CRC细胞信号之间的联系，为深入了解C.B在促进化疗/免疫治疗中的肿瘤发生调节机制提供了线索。
附图说明
[0013]图1中，a)不同浓度的C.B CM处理CRC细胞的生长曲线(HCT116和DLD1细胞为1％、3％的C.B CM,RKO细胞为1％和5％的C.B CM)。用IncuCyte仪测定生长。b)免疫印迹分析C.B CM诱导的CRC细胞(HCT116、DLD1和RKO细胞)中PCNA蛋白的表达。β
‑
肌动蛋白作为内参对照。c)在CRC细胞中使用指定浓度的C.B CM(0.5％，1％，2％)处理后进行集落形成试验。培养基每五天更换一次。d)用1.5％的培养基或1.5％的C.B CM处理5天后CRC患者来源的类器官的图像和定量。比例尺:25μm。e)采用qRT
‑
PCR分析，测定处理6％培养基或者处理6％C.BCM后HCT116细胞中干性标志物的mRNA水平。f)Transwell实验分析显示，对CRC细胞使用指定浓度的C.B CM处理24小时后，C.B CM对CRC细胞中细胞迁移能力的影响。比例尺：100μm。g)Transwell实验分析显示，对CRC细胞使用指定浓度的C.B CM处理24小时后，C.B CM对CRC细胞侵袭能力的影响。比例尺：100μm。h)尾静脉静脉转移扩散试验的示意图。HCT116
‑
Luc肿瘤细胞在静脉注射到BALB/C
‑
nu小鼠(1
×
106cells,200μl)。肿瘤细胞注射后第40天，注射荧光素后肺部IVIS成像。取样进行HE和E
‑
cadherin的IHC染色。比例尺：10X,100μM；40X,25μM。i)流式细胞术分析不同浓度C.B CM(3％、4％、5％ C.B CM处理HCT116细胞，3％、5％、6％C.B CM处理DLD1细胞，4％、6％、8％C.B CM处理RKO细胞)处理过后，CRC细胞凋亡细胞情况。数据以平均值
±
SEM表示。ns,没有意义；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；双向方差分析检验，无配对双尾学生检验和单向方差分析检验。
[0014]图2中，a)对照组和C.B CM处理的HCT116细胞差异基因表达的火山图(|logFC|>0.5,p
‑
value<0.05)。b)基于GSEA分析结果，C.B CM组较对照组显著下调的前20个代表性通路。c)qRT
‑
PCR分析用于测量使用6％培养基或使用6％C.BCM治疗后指示细胞周期相关基因的mRNA水平的变化。d)免疫印迹分析显示不同浓度的C.B CM处理的CRC细胞中指示的细胞周期相关蛋白的蛋白表达(HCT116为3％、4％和6％，DLD1细胞为3％、4％、5％和6％)。e)流式细胞术分析C.BCM治疗后CRC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.丁酸梭菌和/或丁酸梭菌代谢产物联合5
‑
FU和/或anti
‑
PD1在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。2.丁酸梭菌和/或丁酸梭菌代谢产物在制备提高5
‑
FU或a...

【专利技术属性】
技术研发人员：李孟鸿，徐晖，罗海丹，
申请(专利权)人：中山大学附属第六医院，
类型：发明
国别省市：