一种枯草芽孢杆菌口服药物制造技术

本发明专利技术公开了一种枯草芽孢杆菌口服药物，通过以下方法制备：S1、诱导枯草芽孢杆菌产生生物被膜，并对其进行阳性聚合物修饰，使其表面电位为正；S2、水凝胶包被外膜修饰阳性聚合物的枯草芽孢杆菌，制备枯草芽孢杆菌耐酸水凝胶。本发明专利技术通过对枯草芽孢杆菌诱导，产生生物被膜，提高细菌在肠道中的黏附性；同时利用阳性聚合物对细胞进行修饰，结合水凝胶的包载，能够有效抵抗胃蛋白膜的攻击，提高枯草芽孢杆菌的存活率，且包载过程在中性条件下即可完成，进一步保留了枯草芽孢杆菌的活力。进一步保留了枯草芽孢杆菌的活力。进一步保留了枯草芽孢杆菌的活力。

【技术实现步骤摘要】
一种枯草芽孢杆菌口服药物


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种枯草芽孢杆菌口服药物，能有效提高益生菌口服递送过程中存活率和肠道黏附率。

技术介绍

[0002]许多疑难疾病，如阿尔茨海默病、糖尿病和一些癌症，已被证明与肠道细菌的代谢有关。益生菌的补充具有抑制病原体定植和发挥有益作用的能力，是积极调节肠道菌群平衡的有效策略。虽然粪便菌群移植在预防和治疗方面取得了成功，但侵入性手术和不确定的成分在很大程度上限制了手术的实施，这不可避免地导致患者依从性低，以及胃肠道刺激和潜在的并发症。因此，一种非侵入性的方法，如口服将益生菌定植到肠道中是很有意义的，可以为益生菌治疗提供一种替代方法。但是益生菌口服过程中容易受到胃蛋白酶的分解，使得绝大部分失活或死亡，使得治疗结果下降。
[0003]枯草芽孢杆菌(BS)作为一种非常有用的益生菌，分泌的多种胞外酶已应用到许多不同领域中，其中脂肪酶和丝氨酸纤溶蛋白酶(即纳豆激酶)被广泛应用于医药行业。枯草芽孢杆菌脂肪酶具有多种催化能力，其在动物或人体的消化道中与原本存在的消化酶类共同发挥作用，使消化道处于健康的平衡状态。但是直接口服细菌，能够到达肠道的微乎其微，从而限制了枯草芽孢杆菌的功效。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是为了提供一种在口服递送过程中存活率和黏附率较高的益生菌。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术提供了一种枯草芽孢杆菌口服药物，通过以下方法制备：
[0006]S1、诱导枯草芽孢杆菌产生生物被膜，并对其进行阳性聚合物修饰，使其表面电位为正；
[0007]S2、水凝胶包被外膜修饰阳性聚合物的枯草芽孢杆菌，制备枯草芽孢杆菌耐酸水凝胶。
[0008]本专利技术通过对枯草芽孢杆菌诱导，产生生物被膜，提高细菌在肠道中的黏附性；同时利用阳性聚合物对细胞进行修饰，结合水凝胶的包载，能够有效抵抗胃蛋白膜的攻击，提高枯草芽孢杆菌的存活率，且包载过程在中性条件下即可完成，进一步保留了枯草芽孢杆菌的活力。
[0009]本专利技术枯草芽孢杆菌口服药物的具体制备方法如下：
[0010]S1、诱导生物被膜并进行表面修饰
[0011]在MSgg液体培养基中培养细菌，条件为37℃恒温振荡箱，转速220rpm，培养12h。然后取10ul涂板于MSgg培养平板上，37℃恒温培养箱中培养48h，得到具有生物外膜的细菌菌液。
[0012]配置25mg/mL的阳性聚合物溶液(EDAC水溶液，浓度为25mg/mL，并调节到pH7.4或
PAH溶液(100mg溶于4ml 1M NaOH中)，并向具有生物外膜的细菌菌液中加入阳性聚合物溶液，细菌菌液：阳性聚合物溶液为1mL：200μL。
[0013]其中阳性聚合物溶液优选PAH溶液，且阳性聚合物溶液的加入量均以过量为宜。
[0014]S2、耐酸水凝胶的制备
[0015]向阳性聚合物修饰后的细菌菌液中加入羧甲基壳聚糖溶液：配置2％的羧甲基壳聚糖水溶液5ml，将约5
×
104～1.0
×
106个外膜修饰有阳性聚合物的细菌(即步骤S1中制备获得的阳性聚合物修饰后细菌菌液约0.05ml～1ml)加入羧甲基壳聚糖溶液中搅拌均匀。
[0016]再向溶液中加钙离子络合，具体为：2％的羧甲基壳聚糖溶液与25℃下的饱和氯化钙溶液(约为10g氯化钙溶于10ml去离子水)的加入比例为10：1～5：1(V/V)。
[0017]搅拌，静置，形成包裹菌体的凝胶：2％的羧甲基壳聚糖水溶液与25℃下的饱和氯化钙溶液混合后磁力搅拌15min，搅拌条件：磁力搅拌器、温度为常温，转速为450rpm，搅拌15min；并在搅拌完成后，pH调节到7.0，将溶液在常温条件下静置，去除上清液，取絮状沉淀，得到凝胶包裹的细菌。
[0018]其中，细菌优选枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌WB800N，作为一种常用的工程菌，在提高细菌存活率和黏附性的同时，还能够更好的应用于基因工程。
[0019]在部分实施例中，作为优选的，羧甲基壳聚糖溶液与外膜修饰阳性聚合物的枯草芽孢杆菌的加入比例为5ml：5
×
105个细菌。
[0020]本专利技术相比现有技术具有以下优点：
[0021]1、本专利技术对枯草芽孢杆菌诱导，产生生物被膜，口服至小鼠体内能够明显增加细菌的黏附数量。
[0022]2、本专利技术中的方法在中性pH下完成包载的枯草芽孢杆菌，包载后的枯草芽孢杆菌具有更强的活力；并通过对阳性聚合物的筛选，进一步提升枯草芽孢杆菌的包封率。
[0023]3、本专利技术中的方法完成羧甲基壳聚糖凝胶包载细菌修饰后，能够抵抗胃蛋白酶的攻击，提高细菌的存活率，更好的使益生菌在肠道发挥作用。
[0024]4、本专利技术中的枯草芽孢杆菌WB800N为一种常用的工程菌，在提高细菌的生存黏附后，使得该细菌能够更好的应用于基因工程。
[0025]5、本专利技术方法的制备工艺方便快捷、载菌量大、毒副作用低，不影响益生菌活性。
附图说明
[0026]图1为本专利技术枯草芽孢杆菌生物被膜诱导前后的原子力显微镜图；经过诱导后，可以看出表面厚度增加，说明本专利技术提供的方法能够成功诱导枯草芽孢杆菌能够产生生物被膜；
[0027]图2为本专利技术生物膜诱导、包覆凝胶过程中Zeta电势变化；其中，羧甲基壳聚糖包载产生生物被膜的枯草芽孢杆菌在pH值为7.2下进行；
[0028]图3为本专利技术生物膜诱导、包覆凝胶过程中Zeta电势变化；其中，羧甲基壳聚糖包载产生生物被膜的枯草芽孢杆菌在pH值为2下进行；
[0029]图4为本专利技术生物膜诱导、包覆凝胶过程中Zeta电势变化；其中，羧甲基壳聚糖包载修饰后的枯草芽孢杆菌于EDAC修饰到细菌表面后进行；
[0030]图5为本专利技术生物膜诱导、包覆凝胶过程中Zeta电势变化；其中，羧甲基壳聚糖包
载修饰后的枯草芽孢杆菌于PAH修饰到细菌表面后进行；
[0031]图6为经不同处理后细菌的包封效果；
[0032]图7为不同处理后细菌的活力结果；
[0033]图8为不同量的细菌对羧甲基壳聚糖包载量的影响；
[0034]图9为羧甲基壳聚糖包载量对不同量的细菌进行包载效率变化；
[0035]图10为本专利技术生物膜诱导过程中及包覆凝胶后的SEM图；可以看出枯草芽孢杆菌产生生物被膜及凝胶包载后形态的变化；
[0036]图11为本专利技术生物膜诱导过程中及包覆凝胶后的TEM图；
[0037]图12为本专利技术凝胶在人工胃液(pH1.2)处理后的TEM图；水凝胶良好的包覆枯草芽孢杆菌；
[0038]图13为本专利技术水凝胶在不同pH条件下表面形态(SEM图)；在pH 1.2时，水凝胶表面孔道关闭，为细菌避免胃酸侵蚀，起到保护细菌的作用；
[0039]图14为本专利技术凝胶包覆、不包覆的细菌在人工胃液中处理不同时间凝胶中细菌活死染色图；
[0040]图15为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌口服药物，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌口服药物通过以下方法制备：S1、诱导枯草芽孢杆菌产生生物被膜，并对其进行阳性聚合物修饰，使其表面电位为正；S2、水凝胶包被外膜修饰阳性聚合物的枯草芽孢杆菌，制备枯草芽孢杆菌耐酸水凝胶。2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌口服药物，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌耐酸水凝胶中，枯草芽孢杆菌的包载量为4.7
×
104～3.2
×
105cfu/ml。3.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌口服药物，其特征在于，所述阳性聚合物采用EDAC或PAH。4.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌口服药物，其特征在于，对已生成生物被膜的枯草芽孢杆菌进行表面阳性聚合物修饰采用如下方法：配置25mg/ml的阳性聚合物溶液，向具有生物被膜的枯草芽孢杆菌菌液中加入所述阳性聚合物溶液，所述阳性聚合物溶液与枯草芽孢杆菌菌液体积比为200μl:1ml。5.根据权利要求1或3所述的枯草芽孢杆菌口服药物，其特征在于，所述步骤S1中诱导枯草芽孢杆菌产生生物被膜的具体步骤为：在MSgg液体培养基中培养细菌，条件为37℃恒温振荡箱，转...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏栋林，李佳，冯灵子，杨燕光，陈超，王小平，吴玉，
申请(专利权)人：南通市肿瘤医院南通市老年康复医院，
类型：发明
国别省市：