一种新型抗菌肽Dermaseptin-PP的研究方法技术

本发明专利技术公开了一种新型抗菌肽Dermaseptin

【技术实现步骤摘要】
一种新型抗菌肽Dermaseptin
‑
PP的研究方法


[0001]本专利技术涉及生物制药
，具体是涉及一种新型抗菌肽Dermaseptin
‑
PP的研究方法。

技术介绍

[0002]癌症是对人类健康最具威胁的重大疾病之一，其中肺癌是世界上引起死亡最多的癌症之一，发病率和死亡率常均居恶性肿瘤前列。非小细胞肺癌在所有肺癌中占比约85％，且大多数患者确诊时多处于晚期阶段。目前，化疗是临床上最常用的肺癌治疗方法之一。然而，化疗药物常具有缺乏肿瘤靶向性，药物利用率低，副作用大，易引起肿瘤耐药等问题，导致临床疗效欠佳。
[0003]抗菌肽是天然来源的药物，越来越多研究表明许多AMP具有较强的体内外抗肿瘤活性。相比传统化疗药而言，抗菌肽在抗肿瘤方面的优势显著。抗菌肽是一类由10
‑
100个氨基酸组成的短肽类，具有正电性及两亲性。目前，已发现抗菌肽数据库(APD)中超过250 条抗菌肽均具有抗肿瘤作用。抗菌肽的抗肿瘤作用机制可分为两大类：一是选择性膜破坏机制，与其杀菌作用类似，抗菌肽通过静电吸引直接与肿瘤细胞接触，形成穿膜孔洞或破坏直接细胞膜的完整性，使肿瘤细胞死亡；另一类为非膜破坏机制，包括有：破坏肿瘤细胞骨架使其结构紊乱，抑制肿瘤DNA合成，抑制肿瘤血管生成，调节免疫，诱导肿瘤细胞凋亡或坏死等，近年来，阳离子抗菌肽逐渐被证实能通过特异性的破膜作用机制发挥强抗肿瘤作用，这使其成为了最具研究前景的新型抗肿瘤药物之一。此外，许多研究发现阳离子抗菌肽可以通过破坏肿瘤细胞膜从而提高化疗药物的细胞摄取量，甚至在一定程度上逆转肿瘤细胞的化疗耐药性，进而增强化疗药效，逐渐展露其与化疗药物协同抗肿瘤的广阔应用前景。Dermaseptin
‑
PP肽是作者前期从南美树蛙(Phyllomedusa palliata)皮肤分泌物中首次发现并鉴定出的一条属于Dermaseptin家族的阳离子抗菌肽，带4个正电荷。已有多篇研究发现Dermaseptin家族抗菌肽能通过破坏肿瘤细胞膜发挥强抗肿瘤活性。基于此，本研究旨在深入探究Dermaseptin
‑
PP肽的抗肿瘤活性及作用机制，探究其对紫杉醇等常用化疗药物的增效作用，并结合制剂手段实现Dermaseptin
‑
PP与紫杉醇联用进行肺癌治疗。
[0004]本专利技术公开了一种新型抗菌肽Dermaseptin
‑
PP的研究方法，属于生物制药
，其技术要点是：Dermaseptin家族抗菌肽由于通常具有正电性及两亲性，可以选择性的与富含阴离子成分的肿瘤细胞膜通过静电作用而结合，进而插入细胞膜使产生孔洞，造成肿瘤细胞内容物的外泄，从而快速且高效地杀伤肿瘤细胞。此种独特的破膜机制作用迅速，且不易使肿瘤细胞产生耐药性，因此，Dermaseptin家族抗菌肽作为新型抗肿瘤药物具有较好的应用前景，Dermaseptin
‑
PP与Dermaseptin
‑
3的序列相似性高于90％，属于 Dermaseptin家族抗菌肽。Dermaseptin
‑
PP具有强广谱的抗肿瘤活性，其主要机制为破坏肿瘤细胞膜，低浓度肽的破膜作用可提高多种化疗药物的抗肿瘤作用。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的不足，本专利技术实施例的目的在于提供一种新型抗菌肽 Dermaseptin
‑
PP的研究方法，以解决上述
技术介绍
中的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]一种新型抗菌肽Dermaseptin
‑
PP的研究方法，包括步骤如下：
[0008]步骤一：Dermaseptin
‑
PP的分离鉴定，采用电刺激法(5V,50Hz,4ms)获取Phyllomedusa palliata青蛙的皮肤分泌物，冷冻干燥，采用mRNA DIRECT
TM
试剂盒 (BIOTECH，UK)提取皮肤分泌物冻干粉中的poly
‑
A mRNA，根据BD SMART
TM
RACE cDNA Amplification Kit试剂盒的操作说明，将提取的mRNA逆转录合成第一链cDNA，然后对cDNA进行3'
‑
RACE PCR进行扩增，获得全长的pre
‑
pro
‑
Dermaseptin
‑
PP基因，接着，通过琼脂糖凝胶电泳分析RACE PCR产物，并采用Cycle Pure Kit试剂盒(Omega Bio
‑
Tek,USA)对PCR产物进行纯化，接着将目的基因与
‑
T Easy Vector表达载体连接重组，导入JM109高效感受态大肠杆菌中进行扩增，通过蓝白筛选挑选阳性转化子，采用PCR扩增目的基因，进行测序，将碱基序列翻译为氨基酸序列；
[0009]步骤二：Dermaseptin
‑
PP的体内外抗肿瘤活性及机制研究，研究发现阳离子抗菌肽Dermaseptin
‑
PP具有广谱且高效的体外抗肿瘤活性，其中对H157细胞作用最强，证实其主要作用机制为破坏肿瘤细胞膜和诱导肿瘤细胞凋亡，Dermaseptin
‑
PP独特的细胞膜作用机制不易诱导肿瘤细胞产生耐药性，具有较大的抗肿瘤发展潜力，首先采用MTT实验考察了Dermaseptin
‑
PP对H157，MCF
‑
7，PC
‑
3和U251MG的细胞毒性，发现Dermaseptin
‑
PP 能显著抑制四种细胞的增殖，且具有浓度依赖性，表现出了广谱抗肿瘤活性；
[0010]步骤三：Dermaseptin
‑
PP和化疗药物协同抗肺癌活性及其细胞膜活性机制研究，以H157 和A549两种肺癌细胞为模型，考察四种广谱化疗药物(PTX/DTX/DDP/DOX)单用和与低浓度Dermaseptin
‑
PP联用的细胞毒性，MTT实验结果表明：与低浓度Dermaseptin
‑
PP 联用后，四种化疗药对两种细胞的增殖抑制率均有显著提高，IC
50
值均显著降低，药物联用指数CI值提示Dermaseptin
‑
PP与四种化疗药均为协同效果。
[0011]作为本专利技术进一步的方案，所述Dermaseptin
‑
PP的体内外抗肿瘤活性及机制研究包括如下步骤：
[0012]步骤一：细胞复苏及培养，从液氮罐中取出冻存的细胞，在37℃恒温水浴锅中快速升温融化，然后于离心机中离心(8000rpm
×
3min)，喷洒酒精后，于安全柜内弃去上清液，加入1mL完全培养基(含10％FBS和1％双抗)，混悬细胞，然后将细胞悬液转移至中号培养皿内本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
dehydrogenase，LDH)释放率计算公式如下：LDH释放率(％)＝(OD
实验组
‑
OD
对照组
)/(OD
阳性组
‑
OD
对照组
)
×
100
ꢀꢀꢀ
(公式2)步骤四：激光共聚焦显微镜观察Dermaseptin
‑
PP对H157细胞膜的影响；步骤五：Dermaseptin
‑
PP肽对H157细胞凋亡的影响，Dermaseptin
‑
PP肽对H157细胞凋亡的影响包括细胞接种及给药以及式细胞仪检测H157细胞凋亡率两个程序；步骤六：统计学分析，每个实验均重复三次，以GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析，数据以平均值(Mean)
±
标准差(SD)表示，组间两两比较采用t检验(two
‑
tailed Student
’
s tests)，多组间差异比较采用ANOVA方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义；步骤七：得出研究结果，研究结果包括Dermaseptin
‑
PP的体外抗肿瘤活性、LDH释放评价Dermaseptin
‑
PP对H157细胞膜完整性影响、激光共聚焦显微镜观察Dermaseptin
‑
PP对H157细胞膜破坏作用以及Dermaseptin
‑
PP诱导H157细胞凋亡。3.根据权利要求2所述的新型抗菌肽Dermaseptin
‑
PP的研究方法，其特征在于，所述激光共聚焦显微镜观察Dermaseptin
‑
PP对H157细胞膜的影响包括：酶标仪检测，将处于对数生长期的H157肿瘤细胞用0.25％胰蛋白酶
‑
0.02％EDTA消化液消化下来，用培养基混悬得单细胞悬液后，利用血球计数板对细胞进行计数，按照细胞密度1
×
105个/mL，将细胞接种于共聚焦培养皿中，每皿2mL，置于5％CO2，37℃细胞培养箱中过夜培养至细胞单层覆盖率80％；分组及给药，同浓度Dermaseptin
‑
PP(浓度范围为10
‑9‑
10
‑4M)处理H157细胞24h以及高浓度Dermaseptin
‑
PP(浓度为10
‑4M)处理H157细胞不同时间(30min，1h，2h，4h，8h，16h和24h)后对H157细胞膜的破坏情况，实验分为Dermaseptin
‑
PP给药组和空白组，将细胞从培养箱中取出，弃去原培养基，空白组加入1mL新鲜培养基，其他皿细胞加入1mL含不同浓度Dermaseptin
‑
PP的培养基(浓度范围为10
‑9‑
10
‑4M)，继续于培养箱中孵育一定时间；染色，对细胞膜和细胞核进行染色后，利用激光共聚焦成像系统观察给药后的H157细胞形态，直观的观察Dermaseptin
‑
PP肽对肿瘤细胞细胞膜的影响，取出给药结束的共聚焦培养皿，弃去含药培养基，PBS
×
1mL冲洗2次，加入100μL DIL染液(1︰50稀释)，37℃孵育20min，弃去DIL染液，PBS
×
1mL冲洗2次，加入4％多聚甲醛500μL，4℃固定20min。PBS
×
1mL冲洗2次，加入100μL DAPI工作液(1︰100稀释)，室温染色10min，PBS
×
1mL冲洗2次，将细胞保存在1mL Hanks平衡盐溶液(Hanks balanced salt solution,HBSS)中，使用激光共聚焦显微镜观察染色后细胞膜与细胞核，进行拍照记录，DIL染色液可将细胞膜染成红色，DAPI染色液可将细胞核染成蓝色。4.根据权利要求1所述的新型抗菌肽Dermaseptin
‑
PP的研究方法，其特征在于，所述Dermaseptin
‑
PP和化疗药物协同抗肺癌活性及其细胞膜活性机制研究包括如下步骤：步骤一：溶血实验；步骤二：荷H157肺癌皮下瘤裸鼠模型的建立；步骤三：Dermaseptin
‑
PP肽抗肺癌体内药效评价；步骤四：细胞凋亡通路分析及生物安全性评价；以及步骤五：得出研究结果。5.根据权利要求4所述的新型抗菌肽Dermaseptin
‑
PP的研究方法，其特征在于，所述溶血实验包括：
红细胞的制备，家兔腹主动脉取血于肝素抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆洋，杜守颖，董姊怡，郭明雪，
申请(专利权)人：北京中医药大学，
类型：发明
国别省市：