具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解物、地龙蛋白自溶酶解/消化产物及制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解物、地龙蛋白自溶酶解/消化产物及制备方法与应用。本发明专利技术通过新鲜地龙浆加入水或不加水，搅拌进行预酶解，终止反应，冷却；离心，取上清液过滤，取滤液第一次超滤，超滤截留量为5～10kDa，取滤液第二次超滤，超滤截留量为1～3kDa，取滤液透析，透析截留量为100～500Da，再冷冻干燥得地龙蛋白自溶酶解物。预酶解后增加模拟胃肠消化步骤得到地龙蛋白自溶酶解/消化产物。本发明专利技术具有生产方法高效、简便和环保等优点；所得产物具有较好的免疫调节活性，能被作为活性成分用于功能性食品的生产，为免疫调节活性类物质提供了新来源。为免疫调节活性类物质提供了新来源。为免疫调节活性类物质提供了新来源。

【技术实现步骤摘要】
具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解物、地龙蛋白自溶酶解/消化产物及制备方法与应用


[0001]本专利技术属于农产品深加工及其副产品综合利用
，具体涉及一种具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解物、地龙蛋白自溶酶解/消化产物及制备方法与应用。

技术介绍

[0002]地龙，也即蚯蚓，有止咳定惊、平喘和降血压等功效。虽然地龙作为中药已有2300年的历史，但是地龙的药理作用直到近几十年才逐渐展开研究。现代研究发现，地龙的生物活性物质主要有氨基酸、蛋白质和脂肪等，其中蛋白类物质含量高达53.5％～63.1％，具有抗凝血、溶血栓、降压、抑菌和免疫调节等生物活性。
[0003]对地龙蛋白以及多肽的研究，目前多集中于蚓激酶、地龙蛋白和肽段的提取纯化以及生理活性，而少有对于经过胃肠消化后地龙蛋白酶解物或多肽的探究，这是由于地龙被当成食品的概念目前还未被大众所接受。然而，已有相关综述在关注地龙冻干粉作为一种新型可食用蛋白补充剂的可能性，我国也在2009年发布了地龙蛋白作为新资源食品的公告，地龙蛋白作为食品的生理活性已逐渐成为新的研究方向。
[0004]免疫活性肽具有通过调节细胞免疫和体液免疫增强机体免疫功能的效果。免疫调节活性肽多由2～10个氨基酸残基构成，有较好的疏水性。免疫调节肽的特征氨基酸包括疏水性氨基酸、带电荷氨基酸以及等芳香族氨基酸。近年来已有许多研究表明，利用内源酶自溶过程，可以从多种食物蛋白质源中产生具有免疫调节活性的蛋白质水解物或多肽。目前，用于评价免疫调节肽活性的方法包括体外方法(细胞模型)以及体内方法(动物模型)；在细胞模型的活性评价中，小鼠巨噬细胞RAW 264.7是最为常用的一种，评价指标包括TNF
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α、IL
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6及NO等的表达水平。
[0005]已有研究表明，从地龙中提取纯化的蛋白和多肽，可使小鼠巨噬细胞分泌TNF
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α和NO的水平显著提升。但是提纯过程并未经过胃肠模拟消化过程释放多肽，因此，地龙蛋白食用后是否具有免疫调节活性仍值得深入研究(傅炜昕,李建华,董占双,梁再赋,秦博,李铁英,贾秀坤,范世光.免疫活性地龙肽的制备及其对小鼠巨噬细胞活性的影响[J].微生物学杂志,2008(01):36
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40.)。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解物、地龙蛋白自溶酶解/消化产物及制备方法与应用。
[0007]本专利技术目的通过以下技术方案实现：
[0008]具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解物的制备方法，包括以下步骤：
[0009](1)预酶解：新鲜地龙浆加入水或不加水，搅拌进行预酶解，预酶解结束后沸水浴终止反应，冷却；
[0010](2)超滤分级：步骤(1)所得冷却液离心，取上清液过滤，取滤液第一次超滤，超滤
截留量为5～10kDa，取滤液第二次超滤，超滤截留量为1～3kDa，取滤液透析，透析截留量为100～500Da，(透析液)再冷冻干燥得地龙蛋白自溶酶解物。
[0011]优选地，步骤(1)中，所述新鲜地龙浆和水的质量比为1:0～1:2；所述预酶解的温度为25～45℃，时间为2～10h；
[0012]进一步优选地，所述新鲜地龙浆和水的质量比为1:1；所述预酶解的温度为37℃，时间为4h；
[0013]优选地，步骤(1)中，所述沸水浴的时间为10～20min；进一步优选地，所述沸水浴的时间为10min；
[0014]优选地，步骤(1)中，所述冷却的时间为40～60min。进一步优选地，所述冷却的时间为50min。
[0015]优选地，步骤(1)中，所述水为蒸馏水；
[0016]优选地，步骤(2)中，所述离心的条件为12000～13000rpm，10～20min，4～10℃；
[0017]进一步优选地，所述离心的条件为12000rpm，15min，4℃。
[0018]优选地，步骤(2)中，所述过滤的条件为0.22～0.45μm滤膜过滤；进一步优选地，步骤(2)中，所述过滤的条件为0.45μm滤膜过滤。
[0019]优选地，步骤(2)中，所述第一次超滤的条件为截留量10kDa，取分子量<10kDa部分滤液；
[0020]优选地，步骤(2)中，所述第二次超滤的条件为截留量3kDa，取分子量<3kDa部分滤液。
[0021]优选地，步骤(2)中，所述透析截留量为100Da，取分子量>100Da的透析液。
[0022]优选地，步骤(2)中，所述透析用水温度保持在4℃。
[0023]上述的制备方法制备得到的具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解物。
[0024]优选地，所述地龙蛋白自溶酶解物在浓度为500μg/mL时，促进小鼠巨噬细胞RAW 264.7表达细胞因子TNF
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α的水平为4.29～6.92ng/mL，较空白组提高了342.66～613.90％。
[0025]具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解/消化产物的制备方法，包括以下步骤：
[0026](1)预酶解：新鲜地龙浆加入水，搅拌进行预酶解，预酶解结束后沸水浴终止反应，冷却；
[0027](2)模拟胃肠消化：
[0028]模拟胃消化阶段：步骤(1)所得冷却液加入胃蛋白酶搅拌进行第一次酶解反应，调节pH终止模拟胃消化；
[0029]模拟肠消化阶段：模拟胃消化后的溶液加入胰酶搅拌进行第二次酶解反应，煮沸终止模拟肠消化；
[0030](3)超滤分级：步骤(2)所得模拟胃肠消化后的溶液离心，取上清液过滤，取滤液第一次超滤，超滤截留量为5～10kDa，取滤液第二次超滤，超滤截留量为1～3kDa，取滤液透析，透析截留量为100～500Da，(透析液)再冷冻干燥得地龙蛋白自溶酶解/消化产物。
[0031]优选地，步骤(1)中，所述新鲜地龙浆和水的质量比为1:0～1:2；所述预酶解的温度为25～45℃，时间为2～10h；
[0032]进一步优选地，所述新鲜地龙浆和水的质量比为1:1；所述预酶解的温度为37℃，时间为4h；
[0033]优选地，步骤(1)中，所述沸水浴的时间为10～20min；进一步优选地，所述沸水浴的时间为10min；
[0034]优选地，步骤(1)中，所述冷却的时间为40～60min。进一步优选地，所述冷却的时间为50min。
[0035]优选地，步骤(1)中，所述水为蒸馏水；
[0036]优选地，步骤(2)中，所述模拟胃消化阶段的第一次酶解反应的pH为1.5～3.0，时间为1～4h，温度为35～38℃；所述模拟肠消化阶段的第二次酶解反应的pH为7.0～7.5，时间为1～4h，温度为35～38℃。
[0037]进一步优选地，步骤(2)中，所述模拟胃消化阶段的第一次酶解反应的pH为3.0，时间为2h，温度为37℃；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)预酶解：新鲜地龙浆加入水或不加水，搅拌进行预酶解，预酶解结束后沸水浴终止反应，冷却；(2)超滤分级：步骤(1)所得冷却液离心，取上清液过滤，取滤液第一次超滤，超滤截留量为5～10kDa，取滤液第二次超滤，超滤截留量为1～3kDa，取滤液透析，透析截留量为100～500Da，再冷冻干燥得地龙蛋白自溶酶解物。2.根据权利要求1所述具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述新鲜地龙浆和水的质量比为1:0～1:2；所述预酶解的温度为25～45℃，时间为2～10h；所述沸水浴的时间为10～20min；所述冷却的时间为40～60min。3.根据权利要求1所述具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述离心的条件为12000～13000rpm，10～20min，4～10℃；所述过滤的条件为0.22～0.45μm滤膜过滤；所述第一次超滤的条件为截留量10kDa，取分子量<10kDa部分滤液；所述第二次超滤的条件为截留量3kDa，取分子量<3kDa部分滤液。4.权利要求1～3任一项所述的制备方法制备得到的具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解物。5.具有免疫调节活性的地龙蛋白自溶酶解/消化产物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)预酶解：新鲜地龙浆加入水，搅拌进行预酶解，预酶解结束后沸水浴终止反应，冷却；(2)模拟胃肠消化：模拟胃消化阶段：步骤(1)所得冷却液加入胃蛋白酶搅拌进行第一次酶解反应，调节pH终止模拟胃消化；模拟肠消化阶段：模拟胃消化后的溶液加入胰酶搅拌进行第二次酶解反应，煮沸终止模拟...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴晖，张艺哲，张猛猛，潘蕾蔓，贺萍，陈永，杨锦熹，赖富饶，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：