分析乙肝表面抗原病毒样颗粒的全柱成像毛细管等电聚焦电泳的方法技术

本发明专利技术提供了一种分析乙肝表面抗原病毒样颗粒的全柱成像毛细管等电聚焦电泳的方法，其包括如下步骤：配制上样溶液：将乙肝表面抗原病毒样颗粒样品溶液、甲基纤维素溶液、两性电解质载体、等电点标记物、尿素和亚氨基二乙酸溶解于水中，得到上样溶液；其中，所述两性电解质载体为pH 3

【技术实现步骤摘要】
分析乙肝表面抗原病毒样颗粒的全柱成像毛细管等电聚焦电泳的方法


[0001]本专利技术涉及疫苗检测
，具体涉及一种分析乙肝表面抗原病毒样颗粒的全柱成像毛细管等电聚焦电泳的方法。

技术介绍

[0002]乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是乙型肝炎的病原体，主要经输血、静脉注射药品、性行为和母婴垂直传播。在已知的引起病毒性肝炎的病原体中，由HBV所引起的乙型肝炎是一种流行久远、传播广泛、危害严重的传染性疾病。该病发病徐缓，部分患者可转为慢性，少数可导致肝硬化和肝癌。HBV在全世界均有流行，据统计目前全球有20多亿人感染过HBV，其中约有2.4亿慢性HBV感染者，其中，患有慢性乙型肝炎的人群罹患原发性肝细胞癌的相对危险性比普通人群至少增加300倍。因此，HBV防治已成为人民健康与传染病控制中的首要问题。
[0003]乙型肝炎尚无有效治疗手段，免疫接种是预防乙型肝炎最有效的手段，其分为主动免疫和被动免疫。前者即接种乙肝疫苗，刺激机体产生保护性抗体，这种免疫预防作用持久，适用于所有易感染人群；后者即注射乙肝免疫球蛋白(HBIG)，这种免疫主要用于接触后的紧急和暂时性预防，如母婴阻断。因此，注射乙肝疫苗对于提高人群对乙肝的整体免疫水平发挥了重要作用。
[0004]乙肝疫苗分为血源乙肝疫苗和重组乙肝疫苗。较血源乙肝疫苗相比，乙肝基因工程疫苗自获得生产文号投入大量生产以来，免疫接种后更安全可靠。基因工程乙肝疫苗在乙肝计划免疫中日益发挥着重要作用，成为控制乙肝流行的主要疫苗。因此，为确保乙肝疫苗的安全有效、质量可控，对乙肝疫苗的表征分析和质量控制提出了新的要求和挑战。
[0005]毛细管等电聚焦(CIEF)技术最早是根据平板等电聚焦电泳(IEF)的原理建立。它是将带有两性基团的样品、载体两性电解质、缓冲剂和辅助添加剂的混合物注入毛细管内，当在毛细管两端加上直流电压时，载体两性电解质可以在管内形成一定范围的pH梯度，样品组分依据其所带电性向阴极或阳极泳动，柱内pH值与该组分的等电点(pI)相同时，溶质分子的净电荷为零，宏观上该组分将聚集在该点不再进一步迁移，达到使复杂样品中各组分分离的目的。但传统的CIEF技术使用单点检测器，即使所有样品在到达检测器前已经完成分离，也要等到所有聚焦区带都通过检测器后才能结束分离检测。从形成pH梯度到样品聚焦完成通常只需要5min，而聚焦区带依次通过检测器却需要10
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40min。由于传统的CIEF技术使用单点紫外吸收和荧光检测器，不仅增加了额外的分析时间，并且移动过程会导致分离谱带展宽而影响分离度和分辨率，还可能导致蛋白质沉淀；进而使得CIEF技术重现性差。
[0006]全柱成像毛细管等电聚焦电泳(iCIEF)技术是一项相对较新的技术，一直处于商业化状态。近年来，该技术已广泛应用于蛋白质药物和疫苗开发领域，逐渐成为制药行业测量治疗蛋白电荷异质性的重要工具。在iCIEF中，整个毛细管内的等电聚焦(IEF)过程由运
行在280nm的全柱检测系统在线监测。与传统的毛细管等电聚焦电泳(CIEF)相比，iCIEF技术可以同时记录抗体样品的各种带电变异体，而不影响分离分辨率。此外，iCIEF方法的分析时间快，通常在10分钟以下。
[0007]一般来说，基于毛细管电泳(CE)的方法已经越来越多地应用于各种不同类型的蛋白质的分析，然而对于大颗粒，如病毒样颗粒(VLP)，则应用有限。iCIEF技术在VLP和一般生物颗粒表征中的应用已被报道，但尚未发现其应用于表征乙肝表面抗原(HBsAg)。

技术实现思路

[0008]为解决上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种基于全柱成像毛细管等电聚焦电泳(iCIEF)技术的乙肝疫苗的分析方法，该分析方法分析时间短，具有较好的稳定性和重现性，能够高效快速地检测分析乙肝疫苗相关产品。
[0009]为达到上述目的，本专利技术提供一种分析乙肝表面抗原病毒样颗粒的全柱成像毛细管等电聚焦电泳的方法，其包括如下步骤：
[0010]配制上样溶液：将乙肝表面抗原病毒样颗粒样品溶液、甲基纤维素溶液、两性电解质载体、等电点标记物、尿素和亚氨基二乙酸(IDA)溶解于水中，得到上样溶液；其中，所述两性电解质载体为pH 3
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10两性电解质载体；所述亚氨基二乙酸在上样溶液中的摩尔浓度为10
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20mmol/L；
[0011]上机分析：采用全柱成像毛细管等电聚焦电泳测试仪对所述上样溶液进行等电聚焦，聚焦完成后得到等电聚焦图谱。
[0012]全柱成像毛细管等电聚焦电泳(iCIEF)是一种将毛细管等电聚焦电泳与全柱成像技术相结合的新型电泳系统，它结合了毛细管电泳自动分离检测、可定量分析和成像技术的双重优势。iCIEF可对整个毛细管柱进行实时扫描，克服了常规毛细管聚焦电泳技术谱带展宽变形的问题。iCIEF在分析重组生物技术产品，尤其在高度糖基化等复杂样品电荷异质性分析的准确性、重复性和分辨率较平板胶等电聚焦(IEF)和毛细管等点聚焦(CIEF)具有明显的优势，更有利于重组生物技术药物的质量控制和稳定性研究。
[0013]本专利技术选用pH 3
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10两性电解质载体，使样品峰峰型呈正态分布，提高了本专利技术分析方法的准确度和稳定性。尽管乙肝表面抗原病毒样颗粒性质偏酸，等电点偏低，但选用pH更低的两性电解质载体(例如pH 2.5
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5)使得峰型偏态分布，而且会使样品峰左移，靠近检测窗边缘，有可能会造成逃逸现象，影响准确度；此外，加入窄pH范围的两性电解质载体(例如pH 2.5
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5)使得主峰吸光值降低。
[0014]本专利技术还在上样溶液中添加了亚氨基二乙酸(IDA)，乙肝表面抗原病毒样颗粒样品酸性趋势较强，等电点偏低，因此，本专利技术加入亚氨基二乙酸作为阳极占位剂，防止测试过程中样品峰逃逸，确保出峰；此外，加入亚氨基二乙酸并未影响样品峰的分离度。
[0015]本专利技术的分析方法，依据不同电荷变异体的等电点(pI)特征进行测定，分析结果不受干扰，提高了电荷异质性分析的准确性和重复性，通常能在几分钟内完成测定，所需时间大大缩短，可实现高通量检测。本专利技术的分析方法可以监测工艺优化过程中关键质量属性变化情况，可以对制剂进行筛选，监测疫苗产品的批次间差异。
[0016]上述分析乙肝表面抗原病毒样颗粒的全柱成像毛细管等电聚焦电泳的方法中，优选地，所述两性电解质载体在上样溶液中的体积百分比为3
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4vol％。
[0017]上述分析乙肝表面抗原病毒样颗粒的全柱成像毛细管等电聚焦电泳的方法中，优选地，上样溶液中乙肝表面抗原病毒样颗粒的质量浓度为4
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6μg/mL，更优选为5μg/mL。
[0018]在本专利技术的分析方法中，适宜的蛋白浓度会使分析结果具有较好的灵敏度，并获得低丰度电荷异质体的精确定量。如果蛋白浓度过高会导致毛细管中蛋白质聚集、析出，甚至吸附于毛细管，电泳图谱上出现尖峰信号，导本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分析乙肝表面抗原病毒样颗粒的全柱成像毛细管等电聚焦电泳的方法，其包括如下步骤：配制上样溶液：将乙肝表面抗原病毒样颗粒样品溶液、甲基纤维素溶液、两性电解质载体、等电点标记物、尿素和亚氨基二乙酸溶解于水中，得到上样溶液；其中，所述两性电解质载体为pH 3
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10两性电解质载体；所述亚氨基二乙酸在上样溶液中的摩尔浓度为10
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20mmol/L；上机分析：采用全柱成像毛细管等电聚焦电泳测试仪对所述上样溶液进行等电聚焦，聚焦完成后得到等电聚焦图谱。2.根据权利要求1所述的分析乙肝表面抗原病毒样颗粒的全柱成像毛细管等电聚焦电泳的方法，其中，所述两性电解质载体在上样溶液中的体积百分比为3
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4vol％。3.根据权利要求1所述的分析乙肝表面抗原病毒样颗粒的全柱成像毛细管等电聚焦电泳的方法，其中，上样溶液中乙肝表面抗原病毒样颗粒的质量浓度为4
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6μg/mL。4.根据权利要求1所述的分析乙肝表面抗原病毒样颗粒的全柱成像毛细管等电聚焦电泳的方法，其中，所述尿素在上样溶液中的摩尔浓度为3
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5mol/L。5.根据权利要求1所述的分析乙肝表面抗原病毒样颗粒的全柱成像毛细管等电聚焦...

【专利技术属性】
技术研发人员：王辉，汪运洋，宋丹丹，张晋，柳蔷，吴健，谢芳芝，张维，华姗，杨梅芳，陈长江，
申请(专利权)人：北京生物制品研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：