一种测定生物大分子结合界面的方法技术

本发明专利技术提供的一种测定生物大分子结合界面的方法，包括：将待测定的样品注入电泳系统中进行电泳，所述电泳系统中至少一部分的电解质溶液中含有氘代溶剂，电泳系统末端流出的电泳流出液进行质谱检测；在上述方法中，由于电泳系统中至少一部分的电解质溶液中含有氘代溶剂，待测定的样品可以在电泳过程中进行氢/氘交换，通过电泳可以将待测的样品中的各分子及其结合产物分离开，可以使得测定生物大分子结合界面的方法测定结果准确。结合界面的方法测定结果准确。结合界面的方法测定结果准确。

【技术实现步骤摘要】
一种测定生物大分子结合界面的方法


[0001]本专利技术涉及氢/氘交换
，具体涉及一种测定生物大分子结合界面的方法。

技术介绍

[0002]氢/氘交换技术可以用于测定生物大分子结合界面，其原理为：将生物分子A置于氘代溶剂环境中，生物分子A中的活泼氢可以和氘代溶剂中处于活泼氢地位的氘原子发生交换，交换速率和生物分子中活泼氢的溶液可及性(solvent accessibility)相关。在测定生物分子A和另一分子B的非共价结合界面时，处于结合界面上的活泼氢交换速率相比于非结合状态下变慢，因此，通过比较生物分子A各个活泼氢在结合前后的交换速率差异，可以得知哪些活泼氢所处的位置参与形成了结合界面。但是上述氢/氘交换技术测定生物大分子结合界面存在如下缺点：a.为保持生物分子结构和活性，生物分子需要处于溶液中，将生物分子置于氘代溶剂环境，需要将含有生物分子的原溶液和氘代溶剂以一定比例混合，但无论以何种比例混合，总会有原溶液中的水分子残留，水分子会对结果产生干扰；b.氢/氘交换反应需要精确控制反应时间，但实际操作中这种混合的往往是微量样品，均匀程度无法保证，进而无法精确控制反应时间；c.欲得到结果，需要分别测定生物分子A和另一分子B的结合物A
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B中的生物分子A以及单独的生物分子A，如果生物分子A和分子B结合不充分，则样品中既有生物分子A和分子B结合物A
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B又有单独的生物分子A，会相互干扰；d.如果样品含有除A、B以外的其它生物分子成分，也可能对测定结果有干扰。由以上可知，采用氢/氘交换技术测定生物大分子结合界面存在测定结果不准确的问题。
[0003]利用自下而上(bottom
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up)的氢氘交换
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质谱技术测定生物大分子结合界面，其原理为：将发生氢氘交换反应后的生物分子进行酶解，用液相色谱分离各个碎片，用质谱检测生物分子的碎片，测定局部活泼氢的交换速率。但上述方法存在如下缺点：a.氢氘交换反应之后需进行酶解过程及液相色谱分离过程，这时无法使氢/氘交换反应完全停止，如果这些过程中使用普通(非氘代)溶液，则会发生逆交换反应；如果这些过程中使用氘代溶液，则会发生过度反应，都会影响结果的准确性。b.如果生物分子A存在构象异构体(组成成分相同，原子之间的连接相同，但整个分子扭曲、折叠的方式不同)，可能和分子B的结合界面有差别，但自下而上方案无法区分生物分子A的构象异构体。c.干扰问题：如果生物分子A和分子B结合不充分，则样品中既有结合物A
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B又有单独的生物分子A，相互干扰；如果样品含有结构和生物分子A相近的生物分子成分，也可能对测定结果有干扰。d.受酶解得到的碎片大小的影响，空间分辨率较低(得到的结果是相邻的含n个氨基酸残基的片段的整体交换速率；如果n越大，空间分辨率越低)。e.需要分别用2次操作测A
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B中的A和单独的A。由以上可知，采用上述技术测定生物大分子结合界面存在测定结果不准确的问题。
[0004]利用自上而下(top
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down)的氢氘交换
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质谱技术测定生物大分子结合界面，其原理为：将发生氢氘交换反应后的生物分子直接用质谱检测，在质谱内利用气相解离反应把生物分子打碎，测定局部活泼氢的交换速率。上述技术的优点为空间分辨率较高，能直接区分差异较大的构象异构体。但其存在如下的缺点：a.不能直接区分差异较小的构象异构体。
b.干扰问题：生物分子A和分子B结合不充分，则样品中既有结合物A
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B又有单独的生物分子A，相互干扰；如果样品含有结构和生物分子A相近的生物分子成分，也可能对测定结果有干扰。由以上可知，采用上述技术测定生物大分子结合界面存在测定结果不准确的问题。
[0005]除了上述的技术，还可以采用核磁共振技术检测生物分子中各个活泼氢的氢/氘交换速率，但该技术存在如下缺点：a.不能胜任尺寸很大的生物样品；b.对样品纯度要求高，不能测混合物；c.不能在线检测经过某种技术分离后的样品。还可以采用质谱技术检测生物分子局部上活泼氢的氢/氘交换速率；可以在线检测经过某种技术分离后的样品。但如果氢/氘交换反应条件控制不好，测定结果不准；需要和能使生物分子变成碎片的技术结合，才能测定局部的活泼氢，否则只能测定生物分子整体的交换水平。由以上可知，采用上述技术测定生物大分子结合界面存在测定结果不准确的问题。

技术实现思路

[0006]因此，本专利技术要解决的技术问题在于克服现有技术中的测定生物大分子结合界面存在测定结果不准确的缺陷，从而提供一种测定生物大分子结合界面的方法，所述方法测定结果准确。
[0007]为此，本专利技术提供了如下的技术方案：
[0008]一种测定生物大分子结合界面的方法，包括：将待测定样品注入电泳系统中进行电泳，所述电泳系统中，沿着电解质溶液流动方向，至少一部分的电解质溶液中含有氘代溶剂，待测定样品经电泳分离，并经氘代溶剂进行氘标记，将在电泳系统末端流出的电泳流出液进行质谱检测。
[0009]可选的，所述的待测定样品为含有待测定生物大分子A和含有可能与生物大分子A结合的物质B的混合物；所述生物大分子A的分子量≥1000Da。
[0010]本专利技术中所述的生物大分子A为在生物体中起结构作用或者具有一定功能的天然的、或人工合成的、或修饰得到的分子，如蛋白质、核酸、糖类等；物质B可以为任意种类可能与A发生结合的分子，或多个这类分子的组合。
[0011]所述的待测定的样品中可能含有生物大分子A和物质B的结合物A
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B结合物，游离的生物大分子A，游离的物质B，或除生物大分子A或物质B外的其它共存物质。
[0012]本专利技术中所述的电泳系统至少含有两个电极(正电极和负电极)和连通两个电极的电解质溶液，在两个电极上施加电压时，电解质溶液中携带净电荷的物质(包括电解质溶液中的离子，以及注入的待测定的样品中含有的离子)可以在电场的作用下发生定向的移动。
[0013]可选的，所述的电泳系统包括毛细管区带电泳系统、毛细管凝胶电泳系统或毛细管等电聚焦系统。
[0014]可选的，所述氘代溶剂包括重水、氘代甲醇、氘代甲酸或氘代乙酸。
[0015]可选的，在质谱检测时，将在电泳系统末端流出的电泳流出液直接进入质谱检测系统中检测：或
[0016]在质谱检测时，将在电泳系统末端流出的电泳流出液与非变性稀释溶液混合后进入质谱检测系统中检测：或
[0017]在质谱检测时，将在电泳系统末端流出的电泳流出液与变性溶液混合后进入质谱
检测系统中检测。
[0018]可选的，所述变性溶液包括氘代或非氘代形式的有机酸或有机溶剂。
[0019]可选的，所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、异丙醇或乙腈；
[0020]所述有机酸包括甲酸或乙酸。
[0021]可选的，所述非变性稀释溶液包括氘代或非氘代形式的水、醋酸铵溶液或碳酸氢铵溶液，或含增电荷试剂或减电荷试剂的氘代或非氘代形本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种测定生物大分子结合界面的方法，其特征在于，包括：将待测定样品注入电泳系统中进行电泳，所述电泳系统中，沿着电解质溶液流动方向，至少一部分的电解质溶液中含有氘代溶剂，待测定样品经电泳分离，并经氘代溶剂进行氘标记，将在电泳系统末端流出的电泳流出液进行质谱检测。2.根据权利要求1所述的测定生物大分子结合界面的方法，其特征在于，所述的待测定样品为含有待测定生物大分子A和含有可能与生物大分子A结合的物质B的混合物；所述生物大分子A的分子量≥1000Da。3.根据权利要求1或2所述的测定生物大分子结合界面的方法，其特征在于，所述的电泳系统包括毛细管区带电泳系统、毛细管凝胶电泳系统或毛细管等电聚焦系统。4.根据权利要求1
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3任一项所述的测定生物大分子结合界面的方法，其特征在于，所述氘代溶剂包括重水、氘代甲醇、氘代甲酸或氘代乙酸。5.根据权利要求1
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4任一项所述的测定生物大分子结合界面的方法，其特征在于，在质谱检测时，将在电泳系统末端流出的电泳流出液直...

【专利技术属性】
技术研发人员：王冠博，童文骏，
申请(专利权)人：南京视彼泰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：