在基质上使用具有间隙的挂锁对来自组织的基因进行空间测序的方法技术

本发明专利技术涉及在基质上使用具有间隙的挂锁对来自组织的基因进行空间测序的方法。具体而言，本发明专利技术涉及获得包含至少一条m

【技术实现步骤摘要】
在基质上使用具有间隙的挂锁对来自组织的基因进行空间测序的方法


[0001]本专利技术涉及用于在组织上在亚细胞水平上获得基因的测序和空间信息的方法。

技术介绍

[0002]在组织上在亚细胞水平上通过保持空间信息检测所有表达的基因和随后对于潜在的变体来测序那些基因已为具有挑战性的。尤其具有挑战性的是达到亚细胞分辨率。此申请中描述的方法允许低至数十纳米的理论分辨率并允许将组织上的空间信息与所表达基因的测序信息相联系。
[0003]此技术由Spatial Transcriptomics和10X genomic公司开发。在此，由于用预先点标在阵列上的空间标识符给组织RNA分子加标签，因而空间信息得以维持。稍后，通过在例如Illumina上的标准体外NGS测序方法对所得文库进行测序。通过点标的过程，空间标识符在阵列上的位置在测序过程发生之前已知。在空间标识符的测序后，可将连接的感兴趣的RNA序列分配至组织定位。此方法的一个主要限制为该技术的分辨率，由于其依赖于目前仅在多细胞水平上的阵列上斑点的特征尺寸。Spatial Transcriptomics具有多件授权的专利，然而分子被条形码标记且在基质外进行测序。对所有收集的带条形码的分子进行文库制备也是必要的。在此呈现的方法并不将分子从基质上移除，而是直接在基质上确定序列。参考文献为：US20150344942A1 METHODS AND PRODUCT FOR OPTIMISING LOCALISED OR SPATAL DETECTION OF GENE EXPRESSION IN A TISSUE和WO2016162309A1 SPATIALLY DISTINGUISHED, MULTIPLEX NUCLEIC ACID ANALYSIS OF BIOLOGICAL SPECIMENS。
[0004]结合遗传和空间信息的另一种方法公开于WO2012/140224、Fredrik Salm
é
n等人在Nature protocols 2018
ꢀ“
Barcoded solid
‑
phase RNA capture for Spatial Transcriptomics profiling in mammalian tissue”中和Sanja Vickovic等人，“High
‑
density spatial transcriptomics arrays for in situ tissue profiling”, Nature methods, 2019年9月9日。

技术实现思路

[0005]所描述的方法目前被用于检测组织上的mRNA，其具有300
‑
500 nm的高空间分辨率，相较于目前市场上其他竞争方案具有简化的工作流且无需空间标识符。
[0006]因此，本专利技术的目的为获得包含至少一条m
‑
RNA链的样品中的靶序列的空间定位和序列信息的方法，其包含以下步骤：a. 提供具有能够与至少一条m
‑
RNA链结合的数个间隔单元和具有至少一个基准标记物的表面b. 向该表面提供包含至少一条m
‑
RNA链的样品，其中该样品的至少一条m
‑
RNA链与至少一个间隔单元结合，产生至少一种单链寡聚物c. 拍摄该表面的第一图像，以获得该样品相对于基准标记物的空间信息
d. 将样品从表面移除e. 将至少一种包含50
ꢀ‑ꢀ
1000个核苷酸的寡核苷酸用其5
’
和3
’
末端与单链寡聚物的互补部分进行杂交，从而形成挂锁形状的结构，该结构被连接以产生单链环状模板f. 通过能够滚环扩增的聚合酶将单链环状模板扩增成数个DNA多联体(concatemer)，从而形成rolonyg. 获得该rolony的序列信息h. 将样品的空间信息与rolony的序列信息相联系。
[0007]在如图1中所示的本专利技术的第一实施方案中，间隔单元选自包含至少5个，优选5至50个胸腺嘧啶单分子(被称为“多聚
‑
T”)的寡核苷酸，其中与至少一个间隔单元结合的单链寡聚物被逆转录为c
‑
DNA链，且其中mRNA链通过变性移除。
[0008]在如图3中所示的本专利技术的第二实施方案中，间隔单元选自抗体、抗体的Fab片段、单链Fv (scFv)片段、二价单链抗体或双体抗体或适体。优选地，重组人类抗体(eIF4E)或单克隆抗体(抗
‑7‑
甲基鸟苷(m7G) mAb)被用于靶向mRNA在5
’
末端的帽末端。
附图说明
[0009]图1显示本专利技术第一实施方案的一般工作流。
[0010]图2显示本专利技术的表面上间隔单元、基准标记物和组织的空间排列。
[0011]图3显示本专利技术的第二实施方案的一般工作流。
具体实施方式
[0012]本专利技术的方法以几个步骤实施，所述步骤详述如下：步骤a)首先，提供固体扁平二维基质，其具有官能化的表面，例如具有活化的羧酸酯基或琥珀酰亚胺酯。间隔基团连接至此活化的表面。在多聚T基团的变体中，这可通过胺修饰的寡核苷酸实现；在使用抗体的另一个变体中，可使用提供有氨基的寡核苷酸。该固体基质也含有至少一个，优选2个独立的基准标记。
[0013]随后，将m
‑
RNA分子用缓冲溶液加载于表面上。m
‑
RNA分子将与官能化的表面相互作用并且空间上随机地分布于该表面的整个区域上。m
‑
RNA分子的空间或表面密度可由加载的浓度控制。
[0014]间隔单元和因此进而的m
‑
RNA分子优选随机分布于基质上。分布密度可经浓度、温度、pH和表面官能化进行控制。优选地，该样品在提供至表面后被透化。
[0015]步骤b)令组织样品与所有单分子都定位于此的固体基质接触。然后5
‑
50个碱基长的多聚T尾将与在组织中表达的mRNA进行杂交。
[0016]步骤c)组织可任选地例如用DAPI或苏木精或伊红进行染色并成像。还拍摄了那些基准标记的图像，并且记录X
‑
Y位置。记录各单独的单分子的各序列，并将相对于基准标记的空间定位存储为X
‑
Y距离。
[0017]向表面提供样品后，可将该样品染色以获得相对于基准标记物的空间定位。任选
地，将该样品染色以允许确定样品的形态学。
[0018]步骤d)然后将组织从基质上酶促或化学地移除，例如用蛋白酶K移除。然后，可将其上含mRNA的单分子随后逆转录成cDNA。
[0019]作为下一步骤，使其上具有单分子的固体基质变性，以使得双链DNA分子正在形成单链寡核苷酸。
[0020]任选地，样品的空间定位和所测序rolony的空间定位相对于基准标记物的定位进行叠加。
[0021]步骤e)添本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.获得包含至少一条m
‑
RNA链的样品中的靶序列的空间定位和序列信息的方法，其包含以下步骤：a. 提供具有能够与至少一条m
‑
RNA链结合的数个间隔单元和具有至少一个基准标记物的表面b. 向所述表面提供包含至少一条m
‑
RNA链的样品，其中所述样品的至少一条m
‑
RNA链与至少一个间隔单元结合，产生至少一种单链寡聚物c. 拍摄所述表面的第一图像，以获得所述样品相对于所述基准标记物的空间信息d. 将样品从表面移除e. 将至少一种包含50
ꢀ‑ꢀ
1000个核苷酸的寡核苷酸用其5
’
和3
’
末端与所述单链寡聚物的互补部分进行杂交，从而形成挂锁形状的结构，所述结构被连接以产生单链环状模板f. 通过能够滚环扩增的聚合酶将单链环状模板扩增成数个DNA多联体，从而形成rolonyg. 获得所述rolony的序列信息h. 将所述样品的空间信息与所述rolony的序列信息相联系。2.根据权利要求1的方法，其特征在于所述间隔单元选自抗体、抗体的Fab片段、单链Fv (scFv)片段、二价单链抗体或双体抗体或适体。3.根据权利要求1的方法，其特征在于所述间隔单元选自包含至少5个胸腺嘧啶(多聚
‑
T)单分子的寡核苷酸，并且其中与至少一个间隔单元结合的所述单链寡聚物被逆转录成c
‑
DNA链，以及其中所述mRNA链通过变性移除。4.根据权利要求1至3任一项的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：H，
申请(专利权)人：美天施生物科技有限两合公司，
类型：发明
国别省市：