用于信使RNA体外转录的改进方法技术

本发明专利技术提供了用于制备优化的DNA序列作为模板用于mRNA体外转录的方法。优化这些DNA序列以避免RNA聚合酶过早终止转录。本发明专利技术还提供了制备优化的DNA序列的方法，所述优化的DNA序列在其3

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于信使RNA体外转录的改进方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年2月18日提交的美国临时申请序列号62/978,180的优先权，该临时申请的公开内容据此以引用的方式并入。
[0003]序列表
[0004]本说明书参考了序列表(于2020年2月18日以电子形式提交的名为MRT
‑
2121USP1_SL的.txt文件)。.txt文件创建于该日期，并且大小为24,675字节。该序列的全部内容以引用的方式并入本文。

技术介绍

[0005]mRNA疗法对于治疗各种疾病变得越来越重要。据报道，T7和SP6RNA聚合酶在mRNA的体外合成期间都产生异常终止转录物(Nam等人，1988，The Journal of Biological Chemistry,263:34,pp 18123
‑
18127；Lee等人，Nucleic Acids Research 2010,1
‑
9)。在基于体外合成的mRNA的治疗组合物中，这种异常终止转录物的存在会影响其安全性和有效性。
[0006]已知特别是由T7 RNA聚合酶产生的mRNA转录物被比所需转录物更长和更短的RNA污染，例如由于失控转录产生比模板序列更长的延长的转录物。转录物的这些非模板化的延长的部分可以与RNA分子本身或另一个RNA分子退火，以形成分子内或分子间RNA双链体(Gholamalipour等人2018，Nucleic Acids Research，46:18pp 9253
‑
9263)。RNA双链体可以是高度免疫原性的(Mu等人2018，Nucleic Acids Research，46:5239
‑
5249)。使用标准实验室方案不能有效地从体外转录的(IVT)mRNA中去除RNA双链体杂质。最有效的纯化方法被认为是离子对反相高效液相色谱法(HPLC)。然而，这种方法不可成规模使用，需要使用有毒试剂，并且对于许多实验室来说过于昂贵(等人2019，Molecular Therapy:Nucleic Acids，15:26
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35)。在含乙醇的缓冲液中，双链RNA与纤维素的选择性结合最近被确定为从IVT mRNA中去除RNA双链杂质的可成规模使用的方法，尽管这种方法导致RNA产量的显著降低(等人2019，同上)。
[0007]SP6 RNA聚合酶已被用作T7 RNA聚合酶的替代物。然而，当SP6 RNA聚合酶用于体外转录时，不完整的mRNA转录物仍然是个问题。以前曾报道过SP6 RNA聚合酶在rrnB t1终止子中的两个信号(上游和下游信号)处停止转录，并且信号区的改变影响终止效率(Kwon&Kang 1999，The Journal of Biological Chemistry，274:41pp 29149
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29155)。本专利技术人发现rrnB t1样终止信号经常存在于用于mRNA体外转录的模板DNA序列中。另外，他们发现SP6 RNA聚合酶也可以发生失控转录。
[0008]WO 2017/009376提供了从环状DNA产生RNA的方法，其中环状DNA模板序列包括RNA聚合酶启动子序列，然后是编码自切割核酶的序列，然后是RNA聚合酶终止子序列元件。本申请中包括的数据证实对于从包含自切割核酶和两个或四个终止子序列的线性化DNA质粒进行的体外转录，终止效率可达到约95％。这种量级的终止效率不足以用于生产治疗性mRNAs的商业规模过程。
[0009]WO 2012/170443提供了从环状DNA模板产生RNA的方法，其中噬菌体启动子可操作地连接到编码感兴趣的RNA多核苷酸的序列，该序列可操作地连接到多终止子结构域。多终止子结构域包含至少三个选自I类和II类终止信号的终止信号。I类终止信号(以Phi噬菌体T7终止子为例，也称为T7 phi终止子)编码RNA序列，该序列可以形成稳定的茎环结构，然后是一连串6个U残基。II类终止信号(以人类前甲状旁腺激素原(PTH)基因为例)编码6个U残基的中断序列，但缺乏明显的茎环结构。rrnB t1终止信号是II类终止信号。像在WO 2017/009376中一样，在WO 2012/170443的实施例中测试的DNA模板包括在编码感兴趣的RNA多核苷酸的序列和由两个终止子(I类)、两个PTG终止子(II类)和一个pBR322终止子(I类)组成的多重终止子结构域之间编码自切割核酶的序列。
[0010]Du等人(2009,Biotechnol.Biogen.,104(6):1189
‑
1196)认为终止子的大尺寸(100bp)和低效率是有问题的，并且试图通过依次包括1
‑
3个水疱性口炎病毒(vsv)II类终止信号(TATCTGTTAGTTTTTTTC)(每个信号由8个碱基对分开)来提高从环状DNA模板转录期间的终止效率。他们发现，当使用单个vsv终止信号时，终止效率仅为53％
‑
62％。当使用2
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3个vsv终止子时，终止效率增加到65％
‑
75％。
[0011]因此，需要改进的体外转录方法，其产生没有过早终止的转录物和双链mRNA的全长mRNA转录物。

技术实现思路

[0012]本专利技术通过提供制备优化的DNA序列作为mRNA体外转录的模板的方法来满足这种需求。优化这些DNA序列以避免RNA聚合酶过早终止转录。另外，本专利技术还提供了用于制备优化的DNA序列的方法，该序列在其3
’
末端包括一个或多个终止信号。终止信号减少或防止失控转录，并且因此使用这些优化的DNA序列使双链mRNA转录物的形成最小化。
[0013]在一方面，本专利技术涉及用于制备编码蛋白质的优化的DNA序列作为体外转录模板的方法，所述方法包括：(a)提供包含蛋白质编码序列的DNA序列；(b)确定DNA序列中终止信号的存在，其中终止信号具有以下核酸序列：5
’‑
X1ATCTX2TX3‑3’
(SEQ ID NO:1)，其中X1、X2和X3独立地选自A、C、T或G；以及(c)如果存在一个或多个终止信号，通过用其它三个核酸中的任何一个替换所述一个或多个终止信号的位置2、3、4、5和7中任何一个位置的一个或多个核酸来修饰DNA序列，以产生优化的DNA序列，其中，如果需要，选择一个或多个替换核酸以保留由蛋白质编码序列编码的蛋白质的氨基酸序列。
[0014]在一些实施方案中，步骤b和c由计算机执行。
[0015]在一些实施方案中，该DNA序列进一步包含编码5
’
UTR的第一核酸序列和/或编码3
’
UTR的第二核酸序列。
[0016]在一些实施方案中，DNA序列中紧邻终止信号的3
’
的5个核苷酸不包含3个或更多个T核苷酸。
[0017]在一些实施方案中，该方法进一步包括相对本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种制备作为体外转录的模板的编码蛋白质的优化的DNA序列的方法，所述方法包括：a.提供包含蛋白质编码序列的DNA序列；b.确定所述DNA序列中终止信号的存在，其中所述终止信号具有以下核酸序列：5
’‑
X1ATCTX2TX3‑3’
，其中X1、X2和X3独立地选自A、C、T或G；以及c.如果存在一个或多个终止信号，则通过将所述一种或多种终止信号的位置2、3、4、5和7中任何一个位置的一个或多个核酸用其它三个核酸中的任何一个替换来修饰DNA序列，以产生所述优化的DNA序列，其中，如果需要，选择一个或多个替换核酸以保留由所述蛋白质编码序列编码的蛋白质的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的方法，其中步骤b和c由计算机执行。3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述DNA序列进一步包含编码5
’
UTR的第一核酸序列和/或编码3
’
UTR的第二核酸序列。4.如权利要求1
‑
3中任一项所述的方法，其中所述DNA序列中紧邻所述终止信号的3
’
的5个核苷酸不包含3个或更多个T核苷酸。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括相对于编码相同蛋白质序列的野生型DNA序列修饰所述DNA序列的步骤，以优化：a.与mRNA加工和稳定性相关的元件；和/或b.与翻译或蛋白质折叠相关的元件；其中所述修饰在产生所述优化的DNA序列之前进行。6.如权利要求5所述的方法，其中所述与mRNA加工或稳定性相关的元件可以包括隐蔽剪接位点、mRNA二级结构、mRNA的稳定自由能、重复序列和RNA不稳定基序。7.如权利要求5所述的方法，其中所述与翻译或蛋白质折叠相关的元件可以包括密码子使用偏好性、密码子适应性、内部chi位点、核糖体结合位点、过早终止聚A位点、Shine
‑
Dalgarno序列、密码子背景、密码子
‑
反密码子相互作用和翻译暂停位点。8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括合成所述优化的DNA序列的步骤。9.如权利要求8所述的方法，其中所述方法进一步包括将合成的优化的DNA序列插入核酸载体中，以用于体外转录。10.如权利要求9所述的方法，其中所述核酸载体包含可操作地连接至所述优化的DNA序列的RNA聚合酶启动子，任选地，其中所述RNA聚合酶是SP6 RNA聚合酶或T7 RNA聚合酶。11.如权利要求9或10所述的方法，其中核酸载体是质粒。12.如权利要求11所述的方法，其中所述质粒在体外转录之前被线性化。13.如权利要求8
‑
12中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在体外转录中使用所述合成的优化的DNA序列来合成mRNA。14.如权利要求13所述的方法，其中所述mRNA由SP6 RNA聚合酶合成。15.如权利要求14所述的方法，其中所述SP6 RNA聚合酶是天然存在的SP6 RNA聚合酶。16.如权利要求15所述的方法，其中所述SP6 RNA聚合酶是重组SP6 RNA聚合酶。17.如权利要求16所述的方法，其中所述SP6 RNA聚合酶包含标签。18.如权利要求17所述的方法，其中所述标签是his标签。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述mRNA由T7 RNA聚合酶合成。20.如权利要求13
‑
19中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括对合成的mRNA加帽和/或加尾的单独步骤。21.如权利要求13
‑
19中任一项所述的方法，其中加帽和加尾发生在体外转录期间。22.如权利要求13
‑
21中任一项所述的方法，其中所述mRNA在反应混合物中合成，所述反应混合物包含每种NTP浓度范围为1
‑
10mM的NTP、浓度范围为0.01
‑
0.5mg/ml的所述DNA模板和浓度范围为0.01
‑
0.1mg/ml的所述SP6 RNA聚合酶。23.如权利要求22所述的方法，其中所述反应混合物包含每种NTP浓度为5mM的NTP、浓度为0.1mg/ml的所述DNA模板和浓度为0.05mg/ml的所述SP6 RNA聚合酶。24.如权利要求13
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23中任一项所述的方法，其中所述mRNA在37℃
‑
56℃的温度范围内合成。25.如权利要求13
‑
23中任一项所述的方法，其中所述NTP是天然存在的NTP。26.如权利要求13
‑
24中任一项所述的方法，其中所述NTP包括经修饰的NTP。27.一种包括指令的计算机程序，当所述程序由计算机执行时，所述指令使得计算机：a.接收包含蛋白质编码序列的DNA序列，并且b.根据权利要求1
‑
7中任一项所述进行步骤b和c。28.一种计算机可读数据载体，其上存储有权利要求27所述的计算机程序。29.一种数据载体信号，其携带权利要求27所述的计算机程序。30.一种数据处理系统，其包括用于执行权利要求1
‑
7中任一项所述的方法的装置。31.一种制备作为体外转录的模板的编码蛋白质的优化的DNA序列的方法，所述方法包括：a.提供编码蛋白质的DNA序列；以及b.在所述DNA序列的3
’
末端添加一个或多个终止信号以提供所述优化的DNA序列，其中所述一个或多个终止信号包含以下核酸序列：5
’‑
X1ATCTX2TX3‑3’
，其中X1、X2和X3独立地选自A、C、T或G。32.如权利要求31所述的方法，其中所述终止信号包含核酸序列5
’‑
X1ATCTGTT
‑3’
。33.如权利要求31或32所述的方法，其中X1是T。34.如权利要求31或32所述的方法，其中X1是C。35.如权利要求31
‑
34中任一项所述的方法，其中所述终止信号选自5
’‑
TTTTATCTGTTTTTTT
‑3’
、5
’‑
TTTTATCTGTTTTTTTTT
‑3’
、5
’‑
CGTTTTATCTGTTTTTTT
‑3’
、5
’‑
CGTTCCATCTGTTTTTTT
‑3’
、5
’‑
CGTTTTATCTGTTTGTTT
‑3’
、5
’‑
CGTTTTATCTGTTTGTTT
‑3’
或5
’‑
CGTTTTATCTGTTGTTTT
‑
3。36.如权利要求31
‑
35中任一项所述的方法，其中将两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个终止信号添加至所述DNA序列的3
’
末端。37.如权利要求31
‑
36中任一项所述的方法，其中编码所述蛋白质的所述DNA序列进一步包含编码5
’
UTR的第一核酸序列和/或编码3
’
UTR的第二核酸序列。38.如权利要求37所述的方法，其中编码所述蛋白质的所述DNA序列进一步包含编码聚A尾的第三核酸序列。39.如权利要求37所述的方法，其中编码所述蛋白质的所述DNA序列不包含编码聚A尾
的序列。40.如权利要求30
‑
39中任一项所述的方法，其中所述编码所述蛋白质的所述DNA序列不进一步包含编码核酶的DNA序列。41.如权利要求30
‑
34和36
‑
40中任一项所述的方法，其中编码所述蛋白质的所述DNA序列中紧邻所述终止信号3
’
的5个核苷酸不包含3个或更多个T核苷酸。42.如权利要求30
‑
41中任一项所述的方法，其中所述DNA序列包括一个以上的终止信号，并且所述终止信号相隔10个碱基对或更少个碱基对，例如相隔5
‑
10个碱基对。43.如权利要求30
‑
42中任一项所述的方法，其中所述优化的DNA序列包含以下序列：(a)5
’‑
X1ATCTX2TX3‑
(Z
N
)
‑
X4ATCTX5TX6‑3’
或(b)5
’‑
X1ATCTX2TX3‑
(Z
N
)
‑
X4ATCTX5TX6‑
(Z
M
)
‑
X7ATCTX8TX9‑3’
，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8和X9独立地选自A、C、T或G，Z
N
代表N个核苷酸的间隔序列，并且Z
M
代表M个核苷酸的间隔序列，每个核苷酸独立地选自A、C、T或G，并且其中N和/或M独立地为10或更小。44.如权利要求43所述的方法，其中N是5、6、7、8、9或10和/或M是5、6、7、8、9或10。45.如权利要求43和44中任一项所述的方法，其中Z是T。46.如权利要求30
‑
45中任一项所述的方法，其中所述DNA序列相对于编码所述蛋白质的另一序列在以下方面被优化：a.与mRNA加工和稳定性相关的元件；和/或b.与翻译或蛋白质...

【专利技术属性】
技术研发人员：K，
申请(专利权)人：翻译生物公司，
类型：发明
国别省市：