癌细胞中裂解基因的激活制造技术

本公开提供以高特异性诱导EBV早期裂解周期基因(early lytic cycle gene)的方法。这些方法在体外和体内减缓或阻止癌细胞生长。方法在体外和体内减缓或阻止癌细胞生长。方法在体外和体内减缓或阻止癌细胞生长。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】癌细胞中裂解基因的激活
[0001]相关申请
[0002]根据35 U.S.C.
§
119(e)，本申请要求于2020年2月28日提交的美国临时申请号62/983,495的权益，该临时申请通过引用整体并入本文。
[0003]政府许可权
[0004]本专利技术是在美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的1R01HG009900和P30CA03419的政府支持下完成的。政府拥有本专利技术的某些权利。

技术介绍

[0005]EB病毒(EBV)在病因学上与广泛范围的人淋巴恶性肿瘤(B细胞淋巴瘤(BL)、霍奇金病(HD)和其他淋巴瘤)和两种不同类型的上皮癌——胃癌(GC)和鼻咽癌(NPC)相关。EBV相关胃癌占所有胃癌的约10％，并且不是地方病。在全球每年报道的200,000例EBV相关癌症的新病例中，GC和NPC分别为84,000和78,000例。在地方病区，包括香港和中国南方，几乎所有的NPC都属于与EBV感染一致相关的非角化亚型。在16％的常规胃腺癌和89％的淋巴上皮瘤样胃癌中也检测到EBV感染。淋巴上皮样癌(LELC)被定义为具有密集淋巴细胞浸润的低分化癌，并且具有与未分化NPC相似的组织学特征。
[0006]作为复杂的恶性肿瘤，EBV感染和多种遗传畸变的组合导致NPC和GC肿瘤发生。这些EBV相关癌症是来源于EBV潜伏感染的单个祖细胞的克隆恶性肿瘤。据认为，癌变前鼻咽上皮中的遗传改变支持细胞环境转换为支持持续性潜伏性EBV感染。然后EBV感染和潜伏病毒基因(例如EBNA1、LMP1和LMP2A)以及BART
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微小RNA的表达在转化期间驱动受感染上皮细胞的克隆扩增。在肿瘤细胞中的克隆的EBV基因组和病毒转录物的表达强烈暗示EBV在NPC和GC的起始和进展中具有关键作用。

技术实现思路

[0007]在一些方面，本公开提供了用于直接激活EBV裂解基因的有效基因编辑方法和相关工具。本文提供的技术通过利用癌细胞如NPC细胞中EBV附加体的高拷贝数的优势克服了裂解基因表达的高度复杂的调节机制。本文所述的人工转录因子系统利用可编程的DNA结合蛋白，以在EBV阳性癌细胞中实现高效的裂解基因表达。此外，这种EBV
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裂解基因转录的强制激活(包括EBV
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编码的激酶BGLF4的转录)增强了更昔洛韦的抗病毒无毒的前药形式向其细胞毒性DNA复制抑制剂形式(用于细胞裂解治疗)的有效转化。
[0008]在一些方面，本公开是一种用于激活EB病毒(EBV)基因的方法，所述方法包括向感染EBV的细胞中引入：可编程DNA结合蛋白系统，其靶向EBV裂解基因的转录调节序列，和转录激活因子，其与所述可编程DNA结合蛋白系统的组件连接且能够激活所述EBV裂解基因的转录。
[0009]在一些方面，本公开是一种方法，所述方法包括向受试者施用靶向EBV裂解基因的转录调节序列的可编程DNA结合蛋白系统，和与所述可编程DNA结合蛋白系统的组件连接且能够激活所述EBV裂解基因的转录的转录激活因子，其中所述受试者患有与EBV感染相关的
癌症。
[0010]在一些实施方案中，可编程DNA结合蛋白系统包括催化失活的RNA指导的工程化核酸酶(RGEN)或编码催化失活的RGEN的核酸，以及靶向转录调节序列的gRNA或编码靶向转录调节序列的gRNA的核酸。在一些实施方案中，gRNA结合转录调节序列。
[0011]在一些实施方案中，gRNA与Pumilio
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FBF(PUF)结构域结合序列(PBS)连接。在一些实施方案中，转录激活因子与结合gRNA的PBS的PUF结构域连接。在一些实施方案中，催化失活的RGEN或gRNA与转录激活因子连接。在一些实施方案中，催化失活的RGEN是dCas9。
[0012]在一些实施方案中，可编程DNA结合蛋白系统包括与转录激活因子连接的转录激活因子样效应物(TALE)。在一些实施方案中，可编程DNA结合蛋白系统包括与转录激活因子连接的锌指蛋白(ZFP)。
[0013]在一些实施方案中，EBV裂解基因是立即早期病毒反式激活因子。在一些实施方案中，立即早期病毒反式激活因子选自BZLF1和BRLF1。
[0014]在一些实施方案中，EBV裂解基因是蛋白激酶(PK)基因。在一些实施方案中，PK基因是BGLF4。在一些实施方案中，EBV裂解基因是胸苷激酶基因。在一些实施方案中，胸苷激酶基因是BXLF1。在一些实施方案中，EBV裂解基因是DNA聚合酶活性必需的。在一些实施方案中，DNA聚合酶活性必需的EBV裂解基因是BMRF1。
[0015]在一些实施方案中，所述方法还包括向细胞中引入抗病毒剂。在一些实施方案中，抗病毒剂是前药。在一些实施方案中，前药选自更昔洛韦、阿昔洛韦、恩昔洛韦、喷昔洛韦、伐昔洛韦、泛昔洛韦和溴乙烯基脱氧尿苷。在一些实施方案中，前药是更昔洛韦。
[0016]在一些实施方案中，转录调节序列是启动子序列。在一些实施方案中，转录激活因子与转录调节序列结合。在一些实施方案中，转录激活因子包含或编码热休克转录因子1(HSF1)反式激活结构域。在一些实施方案中，转录激活因子包含或编码p65HSF1。
[0017]在一些实施方案中，可编程DNA结合蛋白系统的组件的表达是诱导型的。在一些实施方案中，转录激活因子的表达是诱导型的。
[0018]在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是癌细胞。
[0019]在一些方面，本公开是一种协同EB病毒(EBV)裂解激活的方法，其包括向感染EBV的细胞中引入(a)可编程DNA结合蛋白系统，其靶向EBV BZLF1的转录调节序列和EBV BRLF1的转录调节序列，和(b)转录激活因子，其与所述可编程DNA结合蛋白系统的组件连接且能够激活所述EBV BZLF1和EBV BRLF1的转录，其中由EBV BZLF1和EBV BRLF1调节的基因的表达比由引入仅靶向EBV BZLF1或仅靶向EBV BRLF1的可编程DNA结合蛋白系统导致的相同基因的表达高至少2倍。在一些实施方案中，由EBV BZLF1和EBV BRLF1调节的基因包括EBV蛋白激酶(PK)和EBV早期抗原弥散组分(EA
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D)基因。
[0020]在一些方面，本公开是一种试剂盒，其包括靶向EBV裂解基因的转录调节序列的可编程DNA结合蛋白系统、转录激活因子、和抗病毒剂。在试剂盒的一些实施方案中，转录激活因子与可编程DNA结合蛋白系统的组件连接。在试剂盒的一些实施方案中，抗病毒剂选自更昔洛韦、阿昔洛韦、恩昔洛韦、喷昔洛韦、伐昔洛韦、泛昔洛韦和溴乙烯基脱氧尿苷。在试剂盒的一些实施方案中，抗病毒剂是更昔洛韦(GCV)。在试剂盒的一些实施方案中，EBV裂解基因选自由BZLF1、BRLF1、BGLF4、BXLF1和BMRF1组成的组。
[0021]在一些方面，本公开是一种细胞，其包含靶向E本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】BZLF1或仅靶向EBV BRLF1的可编程DNA结合蛋白系统导致的相同基因的表达高至少2倍，任选地其中由EBV BZLF1和EBV BRLF1调节的所述基因包括EBV蛋白激酶和EBV早期抗原弥散组分。20.一种方法，其包括向受试者施用靶向EBV裂解基因的转录调节序列的可编程DNA结合蛋白系统，和与所述可编程DNA结合蛋白系统的组件连接且能够激活所述EBV裂解基因的转录的转录激活因子，其中所述受试者患有与EBV感染相关的癌症。21.一种试剂盒，其包括：可编程DNA结合蛋白系统，其靶向EBV裂解基因的转录调节序列，所述EBV裂解基因任选地选自由BZLF1、BRLF1、BGLF4、BXLF1和BMRF1组成的组；转录激活因子，其任选地与所述可编程DNA结合蛋白系统的组件连接；以及抗病毒剂，任选地是更昔洛韦(GC...

【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：香港中文大学，
类型：发明
国别省市：