一种基于病毒样颗粒呈递冠状病毒受体结合区的冠状病毒亚单位疫苗制造技术

本发明专利技术公开了一种基于病毒样颗粒呈递冠状病毒受体结合区的冠状病毒亚单位疫苗。本发明专利技术提供了一种重组病毒样颗粒，为携带有特异蛋白的基孔肯雅病毒样颗粒；所述特异蛋白为SARS

【技术实现步骤摘要】
一种基于病毒样颗粒呈递冠状病毒受体结合区的冠状病毒亚单位疫苗


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种基于病毒样颗粒呈递冠状病毒受体结合区的冠状病毒亚单位疫苗。

技术介绍

[0002]冠状病毒是一种有囊膜的正义RNA病毒，属于冠状病毒科冠状病毒属。一些冠状病毒严重威胁人类健康，如导致严重呼吸综合征(SARS)爆发的SARS
‑
CoV和导致中东呼吸综合征(MERS)爆发的MERS
‑
CoV，以及导致新冠病毒肺炎(COVID
‑
19)的SARS
‑
CoV
‑
2。此外，还有一些在人体导致症状较轻疾病的冠状病毒，如HCoV
‑
NL63、HCoV
‑
229E、HCoV
‑
OC43和HCoV
‑
HKU1等。一些冠状病毒还可以感染动物，对宠物健康和牲畜生产造成影响，如猫腹膜炎病毒(FIPV)会导致猫的腹膜炎和腹水、具有高致死率，猪流行性腹泻病毒(PEDV)会导致生猪腹泻、严重威胁生猪的生产。此外，还有可以感染犬、鼠和牛的冠状病毒。抵御病毒感染最有效的方式就是疫苗接种，目前世界各国都在加紧研发针对新型冠状病毒及其它冠状病毒的疫苗。
[0003]在新冠疫情爆发的初期，科学家已经证实该病毒进入细胞采用的受体为细胞表面的蛋白ACE2，而直接介导与ACE2相互作用的是病毒表面刺突蛋白(S)上的受体结合区(RBD)。从自然感染患者体内分离得到的中和抗体大多数能够结合RBD并且阻止RBD与ACE2的相互作用，因此RBD作为免疫原将能够刺激机体产生中和抗体抑制病毒与受体的结合。
[0004]目前的研究显示，将RBD单体或者二聚体蛋白或者编码RBD的mRNA作为疫苗均能够刺激机体产生中和抗体。但RBD单体或者二聚体的免疫原性相对较弱，且目前尚无被批准上市的RNA疫苗，其长期的安全性仍然不明确，因此开发具较高安全性且高免疫原性的RBD亚单位疫苗十分必要。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种基于病毒样颗粒呈递冠状病毒受体结合区的冠状病毒亚单位疫苗。
[0006]第一方面，本专利技术要求保护一种重组病毒样颗粒。
[0007]本专利技术要求保护的重组病毒样颗粒为携带有特异蛋白的基孔肯雅病毒样颗粒；所述特异蛋白为SARS
‑
CoV
‑
2的S蛋白或SARS
‑
CoV
‑
2S蛋白的RBD区段。由病毒样颗粒呈递所述特异蛋白。
[0008]基孔肯雅病毒样颗粒由基孔肯雅病毒的capsid蛋白、E1蛋白、E2蛋白、E3蛋白和6K蛋白自组装形成。基孔肯雅病毒的capsid蛋白、E1蛋白、E2蛋白、E3蛋白、6K蛋白由基孔肯雅病毒多聚蛋白capsid
‑
E3
‑
E2
‑
6K
‑
E1(见图1)被宿主蛋白酶切割产生。
[0009]进一步地，所述重组病毒样颗粒由基孔肯雅病毒的capsid蛋白、基孔肯雅病毒的E1蛋白、融合蛋白A和基孔肯雅病毒的6K蛋白自组装形成。上述各蛋白是由多聚蛋白
“
capsid
‑
融合蛋白A
‑
6K
‑
E1”被宿主蛋白酶切割产生。所述融合蛋白A含有基孔肯雅病毒的E2蛋白、E3蛋白和所述特异蛋白。
[0010]其中，所述特异蛋白替换基孔肯雅病毒E3蛋白与E2蛋白之间的Furin酶切位点。专利技术人尝试了一些附近其他位置，但这些尝试未能检测到VLP的形成。
[0011]进一步地，所述融合蛋白A中还可含有用于纯化的标签蛋白，如Flag标签。
[0012]更进一步地，所述融合蛋白A自N端到C端依次包括基孔肯雅病毒的E3蛋白、所述特异蛋白、基孔肯雅病毒的E2蛋白的N端区段、Flag标签和基孔肯雅病毒的E2蛋白的C端区段。
[0013]其中，所述Flag标签插入到基孔肯雅病毒的E2蛋白的第204位和第205位氨基酸之间。
[0014]更加具体地，所述融合蛋白A自N端到C端依次由基孔肯雅病毒的E3蛋白、柔性肽1、所述特异蛋白、柔性肽2、基孔肯雅病毒的E2蛋白的N端区段、柔性肽3、Flag标签、柔性肽4和基孔肯雅病毒的E2蛋白的C端区段组成。
[0015]其中，用于连接功能蛋白或蛋白功能区的四个柔性肽可根据实际情况设置，包括：若某一个或多个柔性肽前后的功能蛋白或蛋白功能区直接相连不会影响相关蛋白的功能，则可以省去相应柔性肽而采用直接连接法。当然，也可以采用多种柔性肽，如GSGG、GGGS、SGS、SSSG、GGGGS、(GGGGS)n等，只要不影响相关蛋白的功能即可。
[0016]第二方面，本专利技术要求保护如下任一生物材料：
[0017]P1、融合蛋白B，自N端到C端依次由基孔肯雅病毒的capsid蛋白、基孔肯雅病毒的E1蛋白、前文第一方面中所述融合蛋白A和基孔肯雅病毒的6K蛋白组成。
[0018]P2、编码P1中所述融合蛋白B的核酸分子。
[0019]P3、含有P2中所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌。
[0020]所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述融合蛋白B的DNA，该DNA不但可包括启动所述融合蛋白B的编码基因转录的启动子，还可包括终止所述融合蛋白B的编码基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
[0021]进一步地，P3中所述重组载体可为含有所述核酸分子的真核表达载体。
[0022]更进一步地，所述重组载体为将所述核酸分子克隆到pcDNA3.1(+)载体后得到的重组质粒。
[0023]在本专利技术的具体实施方式中，所述重组载体具体为将所述核酸分子取代pcDNA3.1(+)载体的KpnI和XhoI之间的小片段后得到的重组质粒。
[0024]第三方面，本专利技术要求保护前文第一方面中所述重组病毒样颗粒的制备方法。
[0025]本专利技术要求保护的前文第一方面中所述重组病毒样颗粒的制备方法，可包括如下步骤：将前文第二方面中所述的重组载体导入哺乳动物细胞，然后进行细胞培养，进而获得所述重组病毒样颗粒。
[0026]在本专利技术的具体实施方式中，所述哺乳动物细胞为HEK293F细胞。
[0027]在所述方法中，具体是采用SMM293
‑
TII培养基培养HEK293F细胞至对数生长期，然后转染所述重组载体；转染后继续培养24h，然后加入无血清无蛋白补料液的SMS 293
‑
SUPI继续培养48h；然后从细胞培养上清液中获得所述重组病毒样颗粒的。
[0028]进一步地，可按照如下从细胞培养上清液中获得所述重组病毒样颗粒：向所述细胞培养上清液中加入anti
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Flag琼脂糖珠，4℃震荡混匀12h；离心收集琼脂糖珠，转移至重
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组病毒样颗粒，其特征在于：所述重组病毒样颗粒为携带有特异蛋白的基孔肯雅病毒样颗粒；所述特异蛋白为SARS
‑
CoV
‑
2的S蛋白或SARS
‑
CoV
‑
2S蛋白的RBD区段。2.根据权利要求1所述的重组病毒样颗粒，其特征在于：所述重组病毒样颗粒由基孔肯雅病毒的capsid蛋白、基孔肯雅病毒的E1蛋白、融合蛋白A和基孔肯雅病毒的6K蛋白自组装形成；所述融合蛋白A含有基孔肯雅病毒的E2蛋白、E3蛋白和所述特异蛋白；进一步地，所述特异蛋白替换基孔肯雅病毒的E3蛋白与E2蛋白之间的Furin酶切位点。3.根据权利要求2所述的重组病毒样颗粒，其特征在于：所述融合蛋白A中还含有用于纯化的标签蛋白；进一步地，所述标签蛋白为Flag标签；更进一步地，所述融合蛋白A自N端到C端依次包括基孔肯雅病毒的E3蛋白、所述特异蛋白、基孔肯雅病毒的E2蛋白的N端区段、Flag标签和基孔肯雅病毒的E2蛋白的C端区段。4.根据权利要求3所述的重组病毒样颗粒，其特征在于：其特征在于：所述融合蛋白A自N端到C端依次由基孔肯雅病毒的E3蛋白、柔性肽1、所述特异蛋白、柔性肽2、基孔肯雅病毒的E2蛋白的N端区段、柔性肽3、Flag标签、柔性肽4和基孔肯雅病毒的E2蛋白的C端区段组成。5.如下任一生物材料：P1、融合蛋白B，自N端到C端依次由基孔肯雅病毒的capsid蛋白、基孔肯雅病毒的E1蛋白、权利要求2
‑
4任一中的所述融合蛋白A和基孔肯雅病毒的6K蛋白组成；P2、编码P1中所述融合蛋白B的核酸分子；P3、含有P2中所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌。6.根据权利要求5所述的生物材料，其特征在于：P3中所述重组载体为含有所述核酸分子的真核表达载体；进一步地，所述重组载体为将所述核酸分子克隆到pcDNA3.1(+)载体后得到的重组质粒。7.权利要求1
‑
4中任一所述重组病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：将权利要求6中所述的重组载体导入哺乳动物细胞，然后进行细胞培养，进而获得所述重组病毒样颗粒。8.如下任一应用：Q1、权利要求5或6所述生物材料在制备权利要求1
‑
4中任一所述重组病毒样颗粒中的应用；Q2、权利要求1
‑
4中任一所述的重组病毒样颗粒或权利要求5或6所述生物材料在制备用于预防SARS
‑
CoV
‑
2感染所致疾病的产品中的应用。9.一种用于预防SARS
‑
CoV
‑
2感染所致疾病的疫苗，其活性成分为权利要求1
‑
4中任一所述的重组病毒样颗粒；进一步地，所述疫苗中还含有佐剂，如铝佐剂；更进一步地，所述铝佐剂为氢氧化铝佐剂。10.根据权利要求1
‑
9中任一所述的重组病毒样颗粒或生物材料或制备方法或应用或疫苗，其特征在于：所述SARS
‑
CoV
‑
2S蛋白的RBD区段的氨基酸序列如SEQ ID No.5的第325
‑
518位所示；或者来源于SARS
‑
CoV
‑
2且与SEQ ID No.5的第325
‑
518位所示的蛋白质具有
98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；或者将SEQ ID No.5的第325
‑
518位所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；和/或所述基孔肯雅病毒的capsid蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.5的第1
‑
261位所示；或者来源于基孔肯雅病毒且与SEQ ID No.5的第1
‑
261位所示的蛋白质具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；或者将SEQ ID No.5的第1
‑
261位所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；和/或所述基孔肯雅病毒的E1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.5的第1022
‑
1460位所示；或者来源于基孔肯雅病毒且与SEQ ID No.5的第1022
‑
1460位所示的蛋白质具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；或者将SEQ ID No.5的第1022
‑
1460位所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；和/或所述基孔肯雅病毒的6K蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.5的第960
‑
1021位所示；或者来源于基孔肯雅病毒且与SEQ ID No.5的第960
‑
1021位所示的蛋白质具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；或者将SEQ ID No.5的第960
‑
1021位所示的蛋白质经过一个或几个...

【专利技术属性】
技术研发人员：向烨，汪林，荣苗，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：