一种基于LOX1构建的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种基于C型凝集素超家族低密度脂蛋白受体(LOX1)构建的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用。具体地，本发明专利技术提供了一种基于LOX1改造的嵌合抗原受体(CAR)，所述的CAR含有一胞外结合域，所述的胞外结合域能够特异性地靶向热休克蛋白、氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)、磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine)、等LOX1受体。本发明专利技术的CAR免疫细胞具有较强的特异性和靶点亲和力，因此对靶细胞的杀伤能力较强且安全性高。较强且安全性高。

【技术实现步骤摘要】
一种基于LOX1构建的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用


[0001]本专利技术属于免疫细胞治疗领域，具体涉及一种基于LOX1构建的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用。

技术介绍

[0002]肿瘤是威胁人类健康的第二大疾病，2018年全球有18,100,000新增肿瘤患者，肿瘤死亡病例9,500,000。据估计，到2040年肿瘤每年新增29,500,000病例，死亡病例16,400,000。传统的肿瘤治疗手段比如放疗、化疗、手术切除等虽能延缓肿瘤患者的生存期，但患者的生存质量下降、易复发等特点仍制约着传统肿瘤治疗手段。
[0003]2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫疗法已成为继手术、放疗、化疗后的第四种肿瘤治疗手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。嵌合抗原抗体受体(Chimeric Antigen Receptor
‑
T cell,CAR
‑
T)T细胞是指经基因修饰后，能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T细胞。CAR的结构包括一个肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区。细胞目前CART疗法在血液恶性肿瘤中显示了强大的杀伤能力，但实体瘤由于存在肿瘤异质性、缺少肿瘤特异性抗原、肿瘤免疫抑制微环境等限制了CART疗法在实体瘤中的应用。
[0004]热休克应答反应是细胞或组织在面对多种压力刺激时所产生的一种自我保护机制，常伴随有热休克蛋白(Heat Shock Proteins，HSPs)的上调表达。在人中作为最重要的热休克蛋白HSP70在正常生理条件下低表达且定位于细胞内，但在肿瘤细胞过表达，来促进细胞增殖、抑制细胞衰老、抵抗压力诱导的细胞凋亡。在肿瘤细胞中抑制HSP70会导致细胞死亡、裸鼠移植瘤的形成。HSP70在大多数肿瘤样本中高表达，可以作为早期前列腺癌及肝癌的分子标记，与急性髓系白血病、乳腺癌、子宫内膜癌、直肠癌等多种肿瘤预后相关。靶向HSP70表达的方法比如shRNA、CRISPR/Cas9敲除、适体(Aptamers)、抑制剂等均有望成为肿瘤治疗的新手段。但是由于真核生物复杂的热休克蛋白家族，且热休克蛋白家族成员间有一定的功能补偿。上述方法在减弱HSP70表达的同时，HSPs家族其他成员可以补偿HSP70的作用。
[0005]因此，本领域迫切需要开发一种以热休克蛋白为靶点的嵌合抗原受体免疫细胞及其治疗方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的就是提供一种以LOX1受体为靶点的嵌合抗原受体免疫细胞及其制备和应用方法。
[0007]在本专利技术的第一方面，提供了一种基于C型凝集素超家族的低密度脂蛋白受体(LOX1)改造的嵌合抗原受体(CAR)，所述的CAR含有一胞外结合域，所述的胞外结合域能够特异性地结合LOX1受体。
[0008]在另一优选例中，所述的LOX1受体选自下组：热休克蛋白、氧化型低密度脂蛋白
(oxLDL)、磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine)。
[0009]在另一优选例中，所述的胞外结合域具有来源于LOX1的氨基酸序列。
[0010]在另一优选例中，所述的胞外结合域包括LOX1蛋白或其片段。
[0011]在另一优选例中，所述的LOX1蛋白片段包括LOX1蛋白的胞外区。
[0012]在另一优选例中，所述的LOX1蛋白片段包括LOX1蛋白的CTLD区域。
[0013]在另一优选例中，所述的LOX1蛋白或其片段与包括热休克蛋白在内的LOX1受体具有特异性结合。
[0014]在另一优选例中，所述的热休克蛋白选自下组：HSP70、HSP60、HSP90，或其组合。
[0015]在另一优选例中，所述的热休克蛋白是位于细胞膜上(或膜结合)的热休克蛋白(mHSP)。
[0016]在另一优选例中，所述的热休克蛋白选自下组：mHSP70、mHSP60、mHSP90，或其组合。
[0017]在另一优选例中，所述的热休克蛋白是HSP70，优选的是mHSP70。
[0018]在另一优选例中，所述的热休克蛋白来源于人或非人哺乳动物。
[0019]在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括：啮齿动物(如大鼠、小鼠)、灵长动物(如猴)；优选为灵长动物。
[0020]在另一优选例中，所述的热休克蛋白是人源的或猴源的。
[0021]在另一优选例中，所述的热休克蛋白是人源的。
[0022]在另一优选例中，所述的LOX1蛋白或其片段具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或具有如SEQ ID NO:1所示序列的第1至273位(较佳地为第38至273位，更佳地第58至273位，更佳地为151
‑
256位)的氨基酸序列。
[0023]在另一优选例中，所述的LOX1蛋白或其片段中包含CTLD(c
‑
type lectin domain)结构域，所述CTLD结构域的氨基酸序列为对应于SEQ ID NO:1所示序列的151
‑
265位。
[0024]在另一优选例中，所述的LOX1蛋白或其片段的氨基酸序列选自下组：
[0025](i)如SEQ ID NO:1所示序列的第58至273位所示的序列；和
[0026](ii)在如SEQ ID NO:1所示序列的第58至273位所示序列的基础上，进行一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、改变或插入，或在其N端或C端添加1至30个氨基酸残基，较佳地1至10个氨基酸残基，更佳地1至5个氨基酸残基，从而获得的氨基酸序列；并且所述获得的氨基酸序列与如SEQ ID NO:1所示序列的第58至273位所示序列具有≥85％(优选地≥90％，更优选地≥95％，例如≥96％、≥97％、≥98％或≥99％)的序列同一性；并且所获得的氨基酸序列与(i)所示的序列具有相同或相似的功能。
[0027]在另一优选例中，所述CAR的结构如下式I所示：
[0028]L
‑
EB
‑
H
‑
TM
‑
C
‑
CD3ζ
‑
RP
ꢀꢀꢀꢀ
(I)
[0029]式中，
[0030]各
“‑”
独立地为连接肽或肽键；
[0031]L是无或信号肽序列；
[0032]EB是胞外结合域；
[0033]H是无或铰链区；
[0034]TM是跨膜结构域；
[0035]C是无或共刺激信号分子；
[0036]CD3ζ是源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；
[0037]RP是无或报告蛋白。
[0038]在另一优选例中，所述的报告蛋白RP中还包括位于其N端的自剪切识别位点，优选地为T2A序列。
[0039]在另一优选例中，所述的报告蛋白RP为荧光蛋白。
[0040]在另一优选例中，所述的报告蛋白RP为mKate2红色荧光蛋白。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于C型凝集素超家族的低密度脂蛋白受体(LOX1)改造的嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，所述的CAR含有一胞外结合域，所述的胞外结合域能够特异性地结合LOX1受体。2.如权利要求1所述的CAR，其特征在于，所述的胞外结合域包括LOX1蛋白或其片段，所述的LOX1蛋白或其片段具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或具有如SEQ ID NO:1所示序列的第1至273位(较佳地为第38至273位，更佳地第58至273位，更佳地为第151
‑
265位)的氨基酸序列。3.如权利要求1或2所述的CAR，其特征在于，所述CAR的结构如下式I所示：L
‑
EB
‑
H
‑
TM
‑
C
‑
CD3ζ
‑
RP
ꢀꢀ
(I)式中，各
“‑”
独立地为连接肽或肽键；L是无或信号肽序列；EB是胞外结合域；H是无或铰链区；TM是跨膜结构域；C是无或共刺激信号分子；CD3ζ是源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；RP是无或报告蛋白。4.一种核酸分子，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵旭东，孙彬，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：