靶向人血清白蛋白（HSA）的纳米抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了靶向人血清白蛋白(HSA)的纳米抗体、其衍生物、及制备药物的用途。以同组人HSA免疫骆驼构建噬菌体表面展示VHH抗体库，采以人血清白蛋白和食蟹猴血清白蛋白包被酶联板，固相筛选法获得对HSA和cyno SA具有结合能力的VHH抗体克隆。制备相应的嵌合抗体检测抗原亲和力，选择两株VHH抗体2H4和2MG6进行人源化改造及序列优化。对人源化VHH抗体hz2MG6进行小鼠体内活性测定，结果表明将药物与所述抗HSA单域抗体结合能够能有效延长药物的半衰期。期。期。

【技术实现步骤摘要】
靶向人血清白蛋白(HSA)的纳米抗体及其应用
[0001]优先权信息
[0002]本申请请求2021年6月3日向中国国家知识产权局提交的、专利申请号为202110616699.4的专利申请的优先权和权益，并且通过参照将其全文并入此处。


[0003]本专利技术属于抗体工程领域，具体涉及一种用于诊断或治疗肿瘤的治疗性单域抗体，特别是涉及一种靶向人血清白蛋白(HSA)的纳米抗体、其衍生蛋白以及用于制备药物的用途，特别是在将药物负载于白蛋白、延长药物半衰期中的用途。

技术介绍

[0004]单域抗体(single domain antibody，sdAb)是一类特殊的，只包含一条抗体重链的抗体。和传统双链抗体类似，它可以选择性的与特定抗原结合。单域抗体最早在骆驼科动物中被发现，之后在护士鲨等软骨鱼纲动物中也被发现。单域抗体单个重链抗体可变区(VHH)是能完整结合抗原的单个功能域，只有12
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15kDa。VHH结构简单，在与抗原结合时具有高特异性、高亲和力、免疫原性低、渗透性好以及在进行肿瘤治疗时具有接触到不能被常规抗体接触的较为隐蔽靶点的能力等优点。此外，因为单域抗体只有一条链，所以不会产生双链抗体融合时的错配问题。基于这些优点，利用单域抗体作为双特异性抗体的抗原结合序列具有很大的优势，逐渐成为研发热点(Serge Muyldermans(2013)，Annu.Rev.Biochem.82:775
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797)。
[0005]人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是人体血浆中含量最丰富的蛋白质，含量约占血清蛋白的一半，在肝脏中产生，可溶于水，以单体形式存在。血清白蛋白由585个氨基酸组成，包含1个游离Cys和17对二硫键，分子量约为66.5KD。与其他蛋白多肽不同，HSA进入细胞内后在细胞内酸性环境下可以与新生儿受体(FcRn)特异性结合，从而使其免于进入溶酶体降解，并随FcRn返回至细胞表面，因此其血清半衰期可达约21天。HSA是理想的药物载体(Elsadek,B.,&Kratz,F.(2012).Impact of albumin on drug delivery
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new applications on the horizon.J Control Release,157(1),4
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28)，将目的蛋白与HSA融合表达或以非共价连接形式与HSA结合可有效延长目的蛋白半衰期。

技术实现思路

[0006]现有技术中的ScFv、Fab或全IgG类抗HSA抗体分子，结构复杂、分子较大，虽然能将活性分子连接到HSA上，但影响活性分子的功能、方法复杂、负载效率也较低；纳米抗体分子较小、易于操作，但人源化程度低、亲和力不高，延长半衰期的性能有待进一步提高。
[0007]针对上述现有技术的不足，本专利技术提供了一种靶向人血清白蛋白(HSA)的单域抗体、及其衍生物、和制备药物的用途。
[0008]单可变域抗体是目前最小的抗体分子，其分子量是普通抗体的1/10，最初由比利时科学家Hamers，R在骆驼血液中发现，它是工程化抗体产品中备受关注的一类。单可变域
抗体除具备单克隆抗体的抗原反应性外，还拥有一些独特的功能特性，如分子质量小，稳定性强、可溶性好、易表达、靶向性强、人源化简单等，尤其是适合进行双/多特异治疗性抗体的开发和Car
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T/M/NK等疗法的开发。目前单可变域抗体和/或基于单可变域抗体的双/多特异性抗体开发已成为研发热点。
[0009]研究表明，HSA结合蛋白或结合肽在体内也具有较长的半衰期，因此抗HSA抗体可被用于延长蛋白或多肽类药物的半衰期。获得抗HSA抗体可以通过抗原免疫小鼠制备杂交瘤或免疫库进行筛选，并进一步进行人源化改造而获得；也可以通过抗体库技术直接筛选人源抗HSA抗体；上述技术获得的抗体可以是VH+VL组成的ScFv、Fab或全抗体IgG。通过免疫羊驼/骆驼，并制备免疫库，或者通过天然纳米抗体库，利用HSA抗原进行筛选获得抗HSA纳米抗体。Ablynx公司利用HSA的纳米抗体，开发了三特异性抗体Ozoralizumab(ATN
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103)。Ozoralizumab含有3个纳米抗体结构域，其中2个靶向TNFα，1个与HSA结合延长药物半衰期(Fleischmann1,R.M.(2019).A Novel Individualised Treatment Approach in Open
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Label Extension Study of Ozoralizumab.pd.ABLYNX)。目前正在进行临床三期的研究(NCT04077567)。
[0010]专利技术人以同组人HSA免疫骆驼构建噬菌体表面展示VHH抗体库，采以人血清白蛋白和食蟹猴血清白蛋白包被酶联板，固相筛选法获得对HSA和食蟹猴血清白蛋白(Cynomolgus serum albumin，cyno SA)具有结合能力的VHH抗体克隆。制备相应的嵌合抗体检测抗原亲和力，选择两株VHH抗体2H4和2MG6进行人源化及序列优化。利用对鼠血清白蛋白(MSA)具有交叉反应的人源化VHH抗体hz2MG6进行小鼠体内活性测定，结果表明将药物与本专利技术所述抗HSA单域抗体结合能够能有效延长药物的半衰期。
[0011]具体而言，一方面，本专利技术提供了一种具有白蛋白结合功能的分子。根据本专利技术的实施例，该具有白蛋白结合功能的分子包括至少一个白蛋白结合结构域，所述白蛋白结合域包括互补决定区(CDRs)1、2和3，所述CDRs 1、2和3具有所选VHH或其突变体的CDRs1、2和3所示的氨基酸序列，其中，所述突变体是在所述所选VHH的CDRs1、2和3的基础上进行一个或几个氨基酸突变获得的，优选所述一个或几个氨基酸突变为一个、两个、三个、四个或五个氨基酸的替换突变，
[0012]其中，所述所选VHH的CDRs1、2和3的氨基酸序列为下列之一：
[0013](1)所述所选VHH的CDRs1、2和3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.43、44和45所示；
[0014](2)所述所选VHH的CDRs1、2和3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.46、47和48所示；
[0015](3)所述所选VHH的CDRs1、2和3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.43、49和50所示；
[0016](4)所述所选VHH的CDRs1、2和3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.51、52和53所示。
[0017]根据本专利技术的实施例，所述所选VHH的所述突变体的CDRs1、2和3的氨基酸序列为下列之一：
[0018](1)所述所选VHH的所述突变体的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.51所示，CDR2的氨基酸序列如GIYTVGGSTFYTDX
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VKG所示，CDR3的氨基酸序列如GX1TDTAX2LX3X4PX本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有白蛋白结合功能的分子，其特征在于，包括至少一个白蛋白结合结构域，所述白蛋白结合域包括互补决定区(CDRs)1、2和3，所述CDRs 1、2和3具有所选VHH或其突变体的CDRs1、2和3所示的氨基酸序列，其中，所述突变体是在所述所选VHH的CDRs1、2和3的基础上进行一个或几个氨基酸突变获得的，优选所述一个或几个氨基酸突变为一个、两个、三个、四个或五个氨基酸的替换突变，其中，所述所选VHH的CDRs1、2和3的氨基酸序列为下列之一：(1)所述所选VHH的CDRs1、2和3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.43、44和45所示；(2)所述所选VHH的CDRs1、2和3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.46、47和48所示；(3)所述所选VHH的CDRs1、2和3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.43、49和50所示；(4)所述所选VHH的CDRs1、2和3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.51、52和53所示。2.如权利要求1所述具有白蛋白结合功能的分子，其特征在于，所述所选VHH的所述突变体的CDRs1、2和3的氨基酸序列为下列之一：(1)所述所选VHH的所述突变体的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.51所示，CDR2的氨基酸序列如GIYTVGGSTFYTDX
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VKG所示，CDR3的氨基酸序列如GX1TDTAX2LX3X4PX5SFGY所示；(2)所述所选VHH的所述突变体的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.71所示，CDR2的氨基酸序列如AIYTX6SGLSGTTYYADX7VKG所示，CDR3的氨基酸序列如DWKYX8STRCGLEVEYDX9所示，其中，X1为R、E或A；X2为K、E或A；X3为R、E或A；X4为D或E；X5为R、E或A；X6为D或S；X7为S或T；X8为D或E；X9为S或A；X
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为S或T。3.如权利要求1所述具有白蛋白结合功能的分子，其特征在于，所述所选VHH或其所述突变体包括重链可变区，其中，(1)所述重链可变区包含SEQ ID NO:1所示的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；(2)所述重链可变区包含SEQ ID NO:3所示的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；(3)重链可变区包含SEQ ID NO:5所示的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；(4)重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。4.如权利要求3所述具有白蛋白结合功能的分子，其特征在于，所述突变体的所述重链可变区的氨基酸序列是在SEQ ID NO:5所示VHH的基础上进行选自以下任一组合的突变：
V27F+S28T，D54S+S66T，D54E+S66A。5.如权利要求4所述具有白蛋白结合功能的分子，其特征在于，所述突变体的所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:36、38、39或40所示。6.如权利要求3所述具有白蛋白结合功能的分子，其特征在于，所述突变体的所述重链可变区的氨基酸序列是在SEQ ID NO:7所示VHH的基础上进行选自以下任一组合的突变：A14P，A14P+S27F，A14P+S26T，A14P+S27F+S62T，A14P+S27F+S62T+R99E，A14P+S27F+S62T+R99A，A14P+S27F+S62T+K104E，A14P+S27F+S62T+K104A，A14P+S27F+S62T+R106E，A14P+S27F+S62T+R106A，A14P+S27F+S62T+R109E，A14P+S27F+S62T+R109A，A14P+S27F+S62T+R106A+R99E，A14P+S27F+S62T+R106A+R99A，A14P+S27F+S62T+K104E+R99E，A14P+S27F+S62T+K104E+R99A，A14P+S27F+...

【专利技术属性】
技术研发人员：王荣娟，曾大地，刘大涛，张畅，杨莹莹，王双，张锦超，
申请(专利权)人：北京科诺信诚科技有限公司，
类型：发明
国别省市：