【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于抗体工程领域，具体涉及一种用于诊断或治疗肿瘤的治疗性单域抗体，特别是涉及一种靶向lilrb4的纳米抗体、其衍生蛋白以及用于制备药物的用途。
技术介绍
1、纳米抗体是目前最小的抗体分子，最初由比利时科学家hamers在骆驼血液中发现，它是工程化抗体产品中备受关注的一类。纳米抗体主要优点：一是体积是普通抗体的1/10，因为体积小，其在动物组织体内的穿透力强，如，可以通过人体的脑组织，可以达到高密度的肿瘤内部，而普通抗体却不能，这使得可以通过纳米抗体来治疗某些肿瘤或脑部疾病；二是抗原特异性好；三是易于基因改造，方便人工改造以获得对抗不同病原的抗体；四是稳定性高，如，纳米抗体在体内不被自然分解的时间比普通抗体长(意味着药效时间更持久)，纳米抗体甚至能从人胃中通过而保持有效性。
2、lilrb4(又被称作ilt3,lir5,cd85k)是白细胞免疫球蛋白样受体(lilrs/lirs)的成员，是一种在抗原呈递细胞(apc)上发现的免疫调节性跨膜蛋白。lilrb4抑制apc活化并通过t抑制细胞诱导免疫耐受性。它已被证明通过诱导t细胞无反应性和cd8+t抑制细胞的分化来调节免疫反应，并且可能对癌症建立免疫耐受发挥作用。其主要在耐受性树突细胞(dc)、骨髓源性抑制细胞和m2巨噬细胞中表达，少量表达在浆细胞表面，并不在造血前体细胞或者干细胞表面表达。lilrb4是单核细胞急性髓系白血病(monocytic aml)的标志分子，其在monocytic aml细胞表面的高度表达。
3、目前有2款靶向lilrb4的抗
技术实现思路
1、现有技术中的scfv、fab或全igg类抗lilrb4抗体分子，结构复杂、分子较大，虽然能将活性分子连接到lilrb4上，但影响活性分子的功能、方法复杂、负载效率也较低；纳米抗体分子较小、易于操作，但人源化程度低、亲和力不高，延长半衰期的性能有待进一步提高。
2、针对上述现有技术的不足，本专利技术提供一系列抗人lilrb4纳米抗体序列及制备方案。提供的抗lilrb4纳米抗体能高亲和力结合人lilrb4，并在细胞学模型上可以明确观察到对t细胞的激活作用，从而对肿瘤具有潜在的治疗价值。
3、第一方面，本专利技术提供一种靶向lilrb4的纳米抗体，根据本专利技术的实施例，所述纳米抗体能够特异性结合lilrb4，且所述纳米抗体中的vhh链的互补决定区cdr为选自下组的一种或多种：
4、(1)seq id no：10所示的cdr1，或其至多3个氨基酸缺失或取代的变体；seq idno：11所示的cdr2，或其至多3个氨基酸缺失或取代的变体；和seq id no：12所示的cdr3，或其至多3个氨基酸缺失或取代的变体；
5、(2)seq id no：13所示的cdr1，或其至多3个氨基酸缺失或取代的变体；seq idno：14所示的cdr2，或其至多3个氨基酸缺失或取代的变体；和seq id no：15所示的cdr3，或其至多3个氨基酸缺失或取代的变体；
6、(3)seq id no：16所示的cdr1，或其至多3个氨基酸缺失或取代的变体；seq idno：17所示的cdr2，或其至多3个氨基酸缺失或取代的变体；和seq id no：18所示的cdr3，或其至多3个氨基酸缺失或取代的变体。
7、进一步，在本专利技术的一些实施方案中，上述纳米抗体中的vhh链的互补决定区cdr为选自下组的一种或多种：
8、(1)seq id no：10所示的cdr1，seq id no：11所示的cdr2，和seq id no：12所示的cdr3；
9、(2)seq id no：13所示的cdr1，seq id no：14所示的cdr2，和seq idno：15所示的cdr3；
10、(3)seq id no：16所示的cdr1，seq id no：17所示的cdr2，和seq id no：18所示的cdr3；
11、(4)seq id no：13所示的cdr1，seq id no：19所示的cdr2，和seq id no：20所示的cdr3；
12、(5)seq id no：16所示的cdr1，seq id no：21所示的cdr2，和seq id no：18所示的cdr3。
13、进一步，在本专利技术的一些实施方案中，上述纳米抗体是人源化的vhh或骆驼源化的vh。
14、进一步，在本专利技术的一些实施方案中，上述纳米抗体具有如seq id no：3、4、5、7、8、9任一项所示的氨基酸序列。
15、第二方面，本专利技术提供一种融合蛋白，根据本专利技术的实施例，其包括能够特异性结合lilrb4的功能结构域，所述功能结构域由上述任一项所述的抗lilrb4的纳米抗体构成。
16、本专利技术提供的纳米抗体可以与其他的任意蛋白或物质融合，以实现不同的目的，例如与荧光蛋白、酶或放射性元等结合以实现易于检测的目的，再如与治疗lilrb4介导相关疾病的药物分子融合以实现更佳的治疗目的。与该纳米抗体融合的蛋白类型，本领域技术人员可以根据实际需要或目的合理选择，无论融合何种类型的物质融合，其也在本专利技术的范围内。
17、第三方面，本专利技术提供一种抗lilrb4的抗体，根据本专利技术的实施例，所述抗体为传统抗体或其功能性片段，所述抗体的重链可变区由前述任一项所述的抗lilrb4的纳米抗体构成；
18、进一步，上述功能性片段为所述传统抗体的fab、fab’、(fab’)2、fv、scfv或sdfv结构。
19、传统抗体在结构上由两条相同的重链和两条相同的轻链组成，轻链具有轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)；重链具有重链可变区(vh)和重链恒定区(ch1，ch2，ch3和/或ch4)。在本专利技术公开了具有能够特异性结合lilrb4的纳米抗体的结构前提下，本领域技术人员容易想到利用本专利技术的纳米抗体对传统抗体以改造，例如将本专利技术纳米抗体的cdr区结构应用到传统抗体上，以获得可以特异性结合lilrb4的传统抗体，这类传统体也是属于本专利技术的保护范围；进一步地，基于传统抗体的结构，其部分结构例如fab、fab’、(fab’)2、fv、scfv或sdfv结构等也是具有lilrb4结合特异性的，这也是属于本专利技术的保护范围。
20、第四方面，本专利技术提供了一种治疗疾病的组合物，其包括如上任一项所述的抗lilrb4的纳米抗体、如上所述的融合蛋白或如上所述的抗体，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种靶向LILRB4的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体能够特异性结合LILRB4，且所述纳米抗体中的VHH链的互补决定区CDR为选自下组的一种或多种：
2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述互补决定区CDR为选自下组的一种或多种：
3.根据权利要求1或2所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体是人源化的VHH或骆驼源化的VH。
4.根据权利要求1-3任一项所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体具有如SEQ IDNO：3、4、5、7、8、9任一项所示的氨基酸序列。
5.一种融合蛋白，其特征在于，其包括能够特异性结合LILRB4的功能结构域，所述功能结构域由权利要求1-4任一项所述的抗LILRB4的纳米抗体构成。
6.一种抗LILRB4的抗体，其特征在于，所述抗体为传统抗体或其功能性片段，所述抗体的重链可变区由权利要求1-4任一项所述的抗LILRB4的纳米抗体构成；
7.一种药物组合物，其特征在于，其包括权利要求1-4任一项所述的抗LILRB4的纳米抗体、权利要求5所述的融合蛋白或权利要求6所
8.一种分离的核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1-4任一项所述的抗LILRB4纳米抗体、编码权利要求5所述的融合蛋白、或编码权利要求6所述的抗体。
9.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求8所述的核酸分子。
10.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求9所述的表达载体。
11.制备权利要求1-4任一项所述的纳米抗体的方法，其特征在于，其包括：培养权利要求10所述的重组细胞，从培养产物中分离纯化获得所述纳米抗体。
12.一种激活T细胞的方法，包括使T细胞与权利要求1-4任一项所述的抗LILRB4纳米抗体、权利要求5所述的融合蛋白、权利要求6所述的抗体、权利要求7所述的组合物、权利要求8所述的核酸分子、权利要求9所述的载体、或权利要求10所述的重组细胞接触。
13.权利要求1-4任一项所述的抗LILRB4纳米抗体、权利要求5所述的融合蛋白、权利要求6所述的抗体、权利要求7所述的组合物、权利要求8所述的核酸分子、权利要求9所述的载体、或权利要求10所述的重组细胞在制备由人LILRB4蛋白介导的相关疾病的药物中的用途。
...【技术特征摘要】
1.一种靶向lilrb4的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体能够特异性结合lilrb4，且所述纳米抗体中的vhh链的互补决定区cdr为选自下组的一种或多种：
2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述互补决定区cdr为选自下组的一种或多种：
3.根据权利要求1或2所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体是人源化的vhh或骆驼源化的vh。
4.根据权利要求1-3任一项所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体具有如seq idno：3、4、5、7、8、9任一项所示的氨基酸序列。
5.一种融合蛋白，其特征在于，其包括能够特异性结合lilrb4的功能结构域，所述功能结构域由权利要求1-4任一项所述的抗lilrb4的纳米抗体构成。
6.一种抗lilrb4的抗体，其特征在于，所述抗体为传统抗体或其功能性片段，所述抗体的重链可变区由权利要求1-4任一项所述的抗lilrb4的纳米抗体构成；
7.一种药物组合物，其特征在于，其包括权利要求1-4任一项所述的抗lilrb4的纳米抗体、权利要求5所述的融合蛋白或权利要求6所述的抗体，以及药学上可接受的辅料。...
【专利技术属性】
技术研发人员：焦莎莎，王荣娟，王双，张畅，毛冠凡，张锦超，
申请(专利权)人：北京科诺信诚科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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