一种杂交瘤细胞及其分泌的抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体制造技术

本发明专利技术涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种杂交瘤细胞及其分泌的抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体。本发明专利技术以猪流行腹泻病毒株的N蛋白作为免疫原制备得到一株杂交瘤细胞PEDV

【技术实现步骤摘要】
一种杂交瘤细胞及其分泌的抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体


[0001]本专利技术涉及病毒检测
，尤其涉及一种杂交瘤细胞及其分泌的抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体。

技术介绍

[0002]猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪高度接触性肠道传染病。主要危害2周龄以内的仔猪，典型症状为水样腹泻、脱水、呕吐等，PED是世界上流行最广泛的猪病之一。对于养猪行业，以2d～10d的哺乳仔猪发病最为严重，发病率可达100％，病死率达50％～90％。猪流行性腹泻对于养猪业造成了巨大的经济损失。
[0003]PEDV为有囊膜不分节段单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科冠状病毒属I群成员，全长约28 000nt，主要结构蛋白有纤突(Spike，S)蛋白、膜(Membrane，M)蛋白、小膜(Envelope，E)蛋白和核衣壳(Nucleocapsid，N)蛋白。其中N蛋白是PEDV已知结构蛋白中唯一的磷酸化蛋白，由441个氨基酸组成，也是组成病毒核衣壳的结构基础。N蛋白具有保守性强的特点，猪在感染PEDV早期，体内就能产生高水平的抗N蛋白抗体。因而利用N蛋白建立PEDV分子生物学诊断技术具有很好的应用前景。因此，N蛋白是早期准确判断PEDV感染的靶蛋白，同时也普遍用于PED疫苗免疫效果的评估。
[0004]昆虫杆状病毒表达系统(baculovirus expression vector system,BEVS)以昆虫杆状病毒为外源基因载体，昆虫细胞为受体的表达系统。在杆状病毒基因中p10基因和多角体蛋白基因都是极晚期基因，它们的启动子能够高效表达目的蛋白，昆虫细胞与哺乳动物细胞翻译和翻译后蛋白修饰的模式与能力相似，包括糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除及肽段的切割和分解等，得到的重组蛋白抗原性、免疫原性和功能等生物活性与天然蛋白相似；能容纳大分子的插入片段；容易实现大规模低成本生产。该表达系统日益受到人们的重视和广泛应用。
[0005]化学发光酶联免疫方法(Chemiluminescentenzyme immunoassay,CLEIA)是将化学发光体系与酶联免疫分析技术相结合，以化学发光强度与反应物浓度的正比关系，检测微量抗原或抗体的一种新型免疫测定技术。该技术与普通间接ELISA检测方法相比，操作简单，反应时间短；可通过绘制标准曲线实现定量分析；敏感性与精确度明显优于其他方法，标准阳性样本检出率可高达100％；检测范围很广，可达6个数量级。目前，该方法已被广泛应用于人体外诊断试剂如肿瘤标记物检测，丙型肝炎、艾滋病抗体检测，食品安全检测等项目，但在动物疫病检测领域应用尚不广泛。

技术实现思路

[0006]为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供一种杂交瘤细胞及其分泌的抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体，该单克隆抗体特异性强，灵敏度高，可以用于PEDV检测，具有较
高的准确率。
[0007]第一方面，本专利技术提供一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞的保藏编号为：CCTCC No:C2021278。
[0008]本专利技术针对该杂交瘤细胞进行了保藏，保藏信息如下：
[0009]保藏编号：CCTCC No:C2021278，分类命名：杂交瘤细胞株PEDV
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N
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3C8；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国武汉武汉大学邮编：430072；保藏日期：2021年9月30日。
[0010]本专利技术进一步提供由所述的杂交瘤细胞分泌得到的单克隆抗体。
[0011]进一步地，所述单克隆抗体和猪流行性腹泻病毒的N蛋白产生特异性免疫反应。
[0012]本专利技术进一步提供一种猪流行性腹泻病毒的抗原表位肽，所述抗原表位肽可以和所述的单克隆抗体特异性结合。
[0013]本专利技术进一步提供一种核酸，所述核酸用于编码所述单克隆抗体。
[0014]本专利技术进一步提供一种生物材料，所述生物材料包括所述的核酸，所述生物材料为表达盒、载体或转基因细胞。
[0015]第二方面，本专利技术提供所述杂交瘤细胞，或所述单克隆抗体，或所述的核酸在制备猪流行性腹泻病毒检测试剂或试剂盒中的应用。
[0016]本专利技术进一步提供用于检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒，包括所述单克隆抗体。
[0017]进一步地，所述试剂盒为竞争性化学发光酶联免疫试剂盒。
[0018]本专利技术具备如下有益效果：
[0019]本专利技术基于课题组前期分离的基因III群PEDV变异强度株(PEDV
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HNCADC
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2017株)，利用昆虫杆状病毒表达系统对保守性强、覆盖多抗原位点的PEDV N基因进行高效表达，并根据表达得到的N蛋白制备得到一种杂交瘤细胞株PEDV
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N
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3C8，该杂交瘤细胞株可以分泌制备抗N蛋白单克隆抗体。以重组N蛋白、抗N蛋白单克隆抗体为基础，通过优化反应条件，建立PEDV抗体竞争化学发光酶联免疫检测方法。
[0020]本专利技术提供的N蛋白单克隆抗体具备优异的灵敏度和特异性，要显著超过原核表达和合成多肽无法达到的，建立的血清学检测方法覆盖PEDV的全部基因群。
附图说明
[0021]为了更清楚地说明本专利技术或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0022]图1是本专利技术实施例1提供的pFastBac
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N质粒酶切结果；其中M:DL
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10000DNA相对分子质量标准；1：pFastBac
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N未酶切；2：pFastBac
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N双酶切。
[0023]图2是本专利技术实施例1提供的Bacmid
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N PCR鉴定结果；其中M：DL
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5000DNA相对分子质量标准；1：Bacmid
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N质粒；2：阴性对照。
[0024]图3是本专利技术实施例1提供的重组杆状病毒rBV
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N拯救(200X)结果；其中A：正常sf9细胞；B：重组杆粒Bacmid
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N转染sf9细胞病变。
[0025]图4是本专利技术实施例1提供的Western blot鉴定结果；其中M：蛋白质相对分子质量
标准；1:rN蛋白；2:sf9细胞蛋白对照。
[0026]图5是本专利技术实施例1提供的间接免疫荧光(IFA)结果；其中A：PEDV
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N
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3C8单抗；B:PBS阴性对照。
[0027]图6是本专利技术实施例1提供的PEDV
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N
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种杂交瘤细胞PEDV
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N
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3C8，其特征在于，所述杂交瘤细胞的保藏编号为：CCTCC No:C2021278。2.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌得到。3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体和猪流行性腹泻病毒的N蛋白产生特异性免疫反应。4.一种猪流行性腹泻病毒的抗原表位肽，其特征在于，所述抗原表位肽可以和权利要求2或3所述的单克隆抗体特异性结合。5.一种核酸，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫若潜，柴茂，马震原，班付国，王淑娟，杨海波，刘梅芬，刘影，王东方，赵雪丽，谢彩华，王华俊，王翠，郭育培，朱前磊，刘礼杰，赵美雪，李蛟，
申请(专利权)人：河南省动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：