猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，具体涉及猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ‑PCR检测方法。本发明专利技术提供用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒检测的特异性引物和探针，并建立了猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒的三重FQ‑PCR检测方法。本发明专利技术的特异性引物、探针和检测方法的特异性强、灵敏度高、重复性好，为猪腹泻性疾病的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异的临床检测方法。

【技术实现步骤摘要】
猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测方法
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测的引物组、与该引物组配套使用的探针组、试剂盒以及检测方法。
技术介绍
目前，能够引起猪感染的冠状病毒有6种，其中PEDV、PDCoV、SADS-CoV和TGEV主要引起猪群腹泻，PRCV引起猪呼吸道症状，PHEV引起猪呕吐和神经症状。近年来，养猪业饲养方式向更加规模化和集约化转变，同时冠状病毒存在病毒重组进化，使得猪腹泻病的病因也变得越来越复杂。猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的一种急性、高度接触性肠道传染病。可感染各种年龄的猪，尤其对10日龄以内的仔猪危害最为严重，临床上常引起水样腹泻、呕吐和脱水等症状。PEDV为不分节段的单股正链RNA病毒，属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、α-冠状病毒属(Coronavirus)。猪德尔塔冠状病毒(PorcineDeltacoronavirus，PDCoV)和猪急性腹泻综合症冠状病毒(swineacutediarrhoeasyndromecoronavirus，SADS-CoV)是近年来新发现的两种猪冠状病毒。PDCoV和SADS-CoV的基因组同为单股正链不分节段的RNA。PDCoV属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、δ-冠状病毒属(Coronavirus)；SADS-CoV属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、α-冠状病毒属(Coronavirus)。PDCoV和SADS-CoV所引起的临床症状类似于其他已知的猪肠道冠状病毒引起的临诊症状，包括严重且急性的呕吐和腹泻，新生仔猪体重迅速减轻导致急性死亡。由于PEDV、PDCoV和SADS-CoV同属于冠状病毒，且感染猪只后可引起相似的临床症状，因此，难以从感染猪的临床特征和病原的形态上加以区分。而疫病病原的确定是疫病防控的关键一步，因此快速且灵敏地实施对于这三种腹泻病原的鉴别诊断尤为重要。目前，对于SADS-CoV等猪腹泻类疫病检测的PCR方法主要分为两种：一种是以单个病原为检测对象的荧光PCR检测方法，这种方法不能快速确定病原种类，不利于准确了解疫病的流行动态，进行疫病防控；另一种是以多个病原为检测对象的普通PCR检测方法，这种方法操作繁琐,费时费力。实时荧光定量PCR(fluorescentquantitativePCR，简称为FQ-PCR)具有敏感、快速、准确的特点，并且在核酸快速扩增的同时实现模板的定量测定。目前发展起来的多联实时荧光PCR技术可以在同一个PCR反应中，通过荧光基团分析来区分不同的核酸片段，为同时检测多种病原提供了技术基础。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测的引物组、与该引物组配套使用的探针组，本专利技术的另一目的是提供猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测的试剂盒以及检测方法。本专利技术通过对猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒的基因组序列进行分析和比对，筛选在猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒的不同毒株之间具有高度保守性且具有高度特异性的序列作为检测的靶序列，最终确定以PEDV的M基因、PDCoV的M基因和SADS-CoV的N基因中的保守片段作为靶序列。根据上述靶序列分别设计特异性引物和探针，经大量筛选和人工优化获得序列如SEQIDNO.1-6所示的3对特异性引物，这些引物对可单独或配合序列如SEQIDNO.7-9所示的探针实现特异灵敏的三重FQ-PCR检测。具体地，本专利技术的技术方案如下：第一方面，本专利技术提供用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测的引物组，所述引物组包含3对特异性引物，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1-2、SEQIDNO.3-4和SEQIDNO.5-6所示。上述特异性引物中，针对猪流行性腹泻病毒的特异性引物序列如SEQIDNO.1-2所示，针对猪δ冠状病毒的特异性引物序列如SEQIDNO.3-4所示，针对猪急性腹泻综合征冠状病毒的特异性引物序列如SEQIDNO.5-6所示。SEQIDNO.1:PEDV-P1:5’-GGCGCAGGACACATTCTTG-3’；SEQIDNO.2:PEDV-P2:5’-AAGTAGTGAGAAGCGCGTCTGTT-3’；SEQIDNO.3:PDCoV-P4:5’-TCGACCACATGGCTCCAATAC-3’；SEQIDNO.4:PDCoV-P5:5’-CAGCTCTTGCCCATGTAGCTT-3’；SEQIDNO.5:SADS-CoV-P4:5’-CTGGCACTTTTATTACCTTGGTACTG-3’；SEQIDNO.6:SADS-CoV-P5:5’-CCCAATGCACACCCTGAATC-3’。上述特异性引物能够高效特异地结合猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒的靶序列，在同一个PCR体系中相互之间不会产生干扰，能够保证三重FQ-PCR检测的特异性和灵敏度。本专利技术还提供与序列如SEQIDNO.1-6所示的引物组配套使用的探针组，所述探针组包含3条探针，其核苷酸序列如SEQIDNO.7-9所示。上述探针中，与SEQIDNO.1-2所示引物配套使用，针对猪流行性腹泻病毒的探针如SEQIDNO.7所示，与SEQIDNO.3-4所示引物配套使用，针对猪δ冠状病毒的探针如SEQIDNO.8所示，与SEQIDNO.5-6所示引物配套使用，针对猪急性腹泻综合征冠状病毒的探针如SEQIDNO.9所示。SEQIDNO.7:PEDV-Probe3：5’-TGGTCTTTCAATCCTG-3’；SEQIDNO.8:PDCoV-Probe6：5’-CACACCAGTCGTTAAGCATGGCAAGCT-3’；SEQIDNO.9:SADS-CoV-Probe6：5’-TCCTCACGCAGATGCTCCTTTCAGG-3’。上述特异性引物和探针配合使用能够显著提高猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒检测的灵敏度和重复性。上述探针为荧光标记探针，探针的5’端标记荧光基团为选自FAM、VIC、CY5、HEX、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX中的任一种；所述探针的3’端标记淬灭基团为选自MGB、BHQ2、BHQ1、BHQ3、Dabcyl中的任一种。优选地，3条探针的5’本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测的引物组，其特征在于，所述引物组包含3对特异性引物，其核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1-2、SEQ ID NO.3-4和SEQ ID NO.5-6所示。/n

【技术特征摘要】
1.用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测的引物组，其特征在于，所述引物组包含3对特异性引物，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1-2、SEQIDNO.3-4和SEQIDNO.5-6所示。


2.与权利要求1所述的引物组配套使用的探针组，其特征在于，所述探针组包含3条探针，其核苷酸序列如SEQIDNO.7-9所示。


3.根据权利要求2所述的探针组，其特征在于，所述探针的5’端标记荧光基团为选自FAM、VIC、CY5、HEX、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX中的任一种；所述探针的3’端标记淬灭基团为选自MGB、BHQ2、BHQ1、BHQ3、Dabcyl中的任一种；
优选地，3条探针的5’端标记荧光基团分别为FAM、VIC、CY5，3’端标记淬灭基团分别为MGB、BHQ2和BHQ2。


4.权利要求1所述的引物组和权利要求2或3所述的探针组在制备用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒检测的试剂盒中的应用。


5.用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒检测的试剂盒，其特征在于，其包含权利要求1所述的引物组和权利要求2或3所述的探针组。


6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，各引物和探针的工作浓度比为：SEQIDNO.1所示引物、SEQIDNO.2所示引物和SEQIDNO.7所示探针的浓度比为1:1:1；SEQIDNO.3所示引物、SEQIDNO.4所示引物和SEQIDNO.8所示探针的浓度比为1:1:2；SEQIDNO.5所示引物、SEQIDNO.6所示引物和SEQIDNO.9所示探针的浓度比为1:1:2；
优选地，所述试剂盒中，各引物和探针的工作浓度为：SEQIDNO.1所示引物0.3μmol/L、SEQIDNO.2所示引物0.3μmol/L、SEQIDNO.7所示探针0.3μmol/L、SEQIDNO.3所示引物0.2μmol/L、SEQIDNO.4所示引物0.2μmol/L、SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫若潜，班付国，刘影，王东方，谢彩华，杨海波，郭育培，王淑娟，马震原，赵雪丽，王华俊，王翠，柴茂，刘梅芬，朱前磊，申水莹，唐攀，雷从从，杨鹏霞，刘先敏，
申请(专利权)人：河南省动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：河南;41