用于鉴别非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株的二重FQ-PCR检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种用于鉴别非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株的二重FQ‑PCR检测试剂盒。本发明专利技术分别以ASFV的P72基因和CSFV的5’UTR非编码区作为扩增靶区域，各设计1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针(SEQ ID NO:1‑6)，采用实时荧光定量PCR(FQ‑PCR)技术，实现对ASFV和CSFV的鉴别检测。本发明专利技术提供的检测试剂盒适用于疑似ASFV或CSFV感染猪的血清、脾脏、淋巴结、扁桃体、肾脏等样品中的病毒核酸检测，灵敏度可达1.0×10

Dual FQ-PCR kit for identification of wild strains of African swine fever virus and swine fever virus

【技术实现步骤摘要】
用于鉴别非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株的二重FQ-PCR检测试剂盒
本专利技术涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种用于鉴别非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株的二重FQ-PCR检测试剂盒。
技术介绍
非洲猪瘟(Africanswinefever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种高度接触性传染疾病，可引起猪高热、精神沉郁、皮肤发绀、食欲废绝、出血性病变和共济失调，并伴有严重的血小板和淋巴细胞减少，感染动物通常在感染后10d～14d内死亡，病死率可达100％。ASFV基因组为双链DNA，大小170-190kb。病毒基因可编码200多种蛋白质，其中结构蛋白有54种，P72是一种结构蛋白，是病毒衣壳的主要组成部分，P72基因序列保守，不同毒株之间都有相同的保守序列。猪瘟(ClassicalSwineFever，CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的猪的接触性传染病，死亡率高。该病临床症状和死后病变与ASF极为相似，实验室检测是区分两种疫病的唯一方法。CSFV基因组结构主要由5’非编码区(5’UTR)、开放阅读框(ORF)和3’非编码区(3’UTR)三部分组成。5’UTR由360-374个碱基组成，具有很高的保守性，能够形成复杂稳定的二级结构。TaqManMGB探针具有以下优点：一是MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团，其本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度，增加荧光PCR的特异性；同时探针上还连接有MGB修饰基团，可以将探针的Tm值提高10℃左右，提高了荧光PCR的特异性；二是MGB探针可以区分扩增目的片段DNA中1个碱基的差别，荧光PCR的特异性大大增强。因此TaqManMGB探针荧光定量PCR技术比普通荧光定量PCR技术具有更高的灵敏性、特异性。目前国内外尚未见可同时检测ASFV和CSFV的二重FQ-PCR方法的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供分别用于检测非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株的FQ-PCR引物和探针。本专利技术的另一目的是提供用于鉴别非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株的二重FQ-PCR检测试剂盒。本专利技术构思如下：根据ASFV的P72基因和CSFV的5’UTR非编码区序列保守的特点，分别比对GenBank中ASFV的P72基因和CSFV的5’UTR非编码区序列，设计两对特异性引物对和两条TaqManMGB探针，通过优化反应体系及反应条件，可实现在一个反应中同时对ASFV和CSFV进行快速鉴别检测。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种用于检测非洲猪瘟病毒的FQ-PCR引物和探针，它们的核苷酸序列如下：ASFV-P1：5'-ATGGGCAGCTTCAAACGTTT-3'ASFV-P2：5'-ACGGCGCCCTCTAAAGGT-3'ASFV-Probe-P5：5'-F1-CTCGCAACGGATATGACTGGGACAACC-Q-3'；其中，F1为荧光基团VIC或FAM，Q为荧光淬灭基团MGB。第二方面，本专利技术提供一种用于检测猪瘟病毒野毒株的FQ-PCR引物和探针，它们的核苷酸序列如下：CSFV-P3：5'-AGCCATGCCCACAGTAGGAT-3'CSFV-P4：5'-ACCAGGGAGCTCGCCAC-3'CSFV-Probe-P6：5'-F2-GCAAACGGAGGGACTTA-Q-3'其中，F2为荧光基团VIC或FAM，Q为荧光淬灭基团MGB。第三方面，本专利技术提供用于检测非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株的FQ-PCR引物和探针组合，包括上述用于检测非洲猪瘟病毒的FQ-PCR引物和探针以及用于检测猪瘟病毒野毒株的FQ-PCR引物和探针，且F1、F2为不同的荧光基团。第四方面，本专利技术提供含有上述用于检测非洲猪瘟病毒的FQ-PCR引物和探针、用于检测猪瘟病毒野毒株的FQ-PCR引物和探针，或所述引物和探针组合的检测试剂或试剂盒。第五方面，本专利技术提供用于鉴别非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株的二重FQ-PCR检测试剂盒，所述试剂盒包含上述引物和探针组合；所述试剂盒任选包括PrimeScriptRTMasterMix、TaqDNA聚合酶、dNTPs、反应缓冲液、阳性标准品、阴性对照等中的至少一种。所述阳性标准品通过如下方法制备得到：①从非洲猪瘟阳性样品中提取DNA；②从猪瘟病毒野毒株阳性样品中提取RNA，将RNA反转录成cDNA；③利用权利要求1和2中所述的引物分别对非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株的DNA和cDNA进行PCR扩增，得到各自的扩增产物，将得到的扩增产物与载体连接构建得到重组质粒，即为阳性标准品。所述阴性对照为溶解阳性标准品的灭菌去离子水。分别设置ASFV、CSFV检测体系为VIC和FAM荧光通道。第六方面，本专利技术提供上述引物和探针组合，或者上述二重FQ-PCR检测试剂盒在ASFV、CSFV联合检测中的应用。第七方面，本专利技术提供用于鉴别ASFV和CSFV的二重TaqManMGBFQ-PCR反应体系，所述反应体系包括上述引物和探针组合、DNA模板、cDNA模板、DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液。优选地，所述反应体系为：引物ASFV-P1、ASFV-P2、CSFV-P3、CSFV-P4终浓度各为0.4μmol/L，探针ASFV-Probe-P5终浓度为0.4μmol/L，探针CSFV-Probe-P6终浓度为0.6μmol/L，2.5mmol/LdNTPs2μL，10×ExTaq酶缓冲液2.5μL，5U/μLExTaqDNA聚合酶0.3μL，ASFVDNA模板2μL，CSFVcDNA模板2μL，去离子水补足至总体积25μL。第八方面，本专利技术提供非诊断目的的非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株的二重FQ-PCR检测方法，包括以下步骤：1)提取待测样本DNA和RNA，将RNA反转录成cDNA；2)以步骤1)的DNA和cDNA为模板，利用上述引物和探针组合进行二重PCR扩增反应；3)分析PCR产物，根据扩增反应结果判定待测样本中是否含有非洲猪瘟和/或猪瘟病毒野毒株。优选地，步骤2)中所用反应体系为：引物ASFV-P1、ASFV-P2、CSFV-P3、CSFV-P4终浓度各为0.4μmol/L，探针ASFV-Probe-P5终浓度为0.4μmol/L，探针CSFV-Probe-P6终浓度为0.6μmol/L，2.5mmol/LdNTPs2μL，10×ExTaq酶缓冲液2.5μL，5U/μLExTaqDNA聚合酶0.3μL，DNA模板2μL，cDNA模板2μL，去离子水补足至总体积25μL。步骤2)中扩增反应程序为：94℃5分钟；94℃15秒，60℃30秒，共40个循环。本专利技术中，检测结果的判定方式可以为：阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准，可根据不同仪器噪音情况进行调整。阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线，且Ct值＞38.0或无Ct；阳性标准品的Ct值应≤25.0，且出现特定的扩增曲线，判定检测结果成立。如阴性对照和阳性对照结果不满足以上条件，此次实验视为无效。在检测结果成立的情况下，步骤3)结果判定的具体方法为：①若待测样本的FQ-PCR反应体系通道出现2条特定的扩增曲线，且Ct值≤35.0，则可判定为样品中同时存在非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株；②若待测样本的FQ-PCR反应体系通道无特定的扩增曲线本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测非洲猪瘟病毒的FQ‑PCR引物和探针，其特征在于，它们的核苷酸序列如下：ASFV‑P1：5'‑ATGGGCAGCTTCAAACGTTT‑3'ASFV‑P2：5'‑ACGGCGCCCTCTAAAGGT‑3'ASFV‑Probe‑P5：5'‑F1‑CTCGCAACGGATATGACTGGGACAACC‑Q‑3'；其中，F1为荧光基团VIC或FAM，Q为荧光淬灭基团MGB。

【技术特征摘要】
1.用于检测非洲猪瘟病毒的FQ-PCR引物和探针，其特征在于，它们的核苷酸序列如下：ASFV-P1：5'-ATGGGCAGCTTCAAACGTTT-3'ASFV-P2：5'-ACGGCGCCCTCTAAAGGT-3'ASFV-Probe-P5：5'-F1-CTCGCAACGGATATGACTGGGACAACC-Q-3'；其中，F1为荧光基团VIC或FAM，Q为荧光淬灭基团MGB。2.用于检测猪瘟病毒野毒株的FQ-PCR引物和探针，其特征在于，它们的核苷酸序列如下：CSFV-P3：5'-AGCCATGCCCACAGTAGGAT-3'CSFV-P4：5'-ACCAGGGAGCTCGCCAC-3'CSFV-Probe-P6：5'-F2-GCAAACGGAGGGACTTA-Q-3'其中，F2为荧光基团VIC或FAM，Q为荧光淬灭基团MGB。3.用于检测非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株的FQ-PCR引物和探针组合，其特征在于，包括权利要求1和2所述的引物和探针，且F1、F2为不同的荧光基团。4.含有权利要求1或2所述引物和探针，或权利要求3所述引物和探针组合的检测试剂或试剂盒。5.用于鉴别非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株的二重FQ-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求3所述的引物和探针组合；所述试剂盒任选包括PrimeScriptRTMasterMix、TaqDNA聚合酶、dNTPs、反应缓冲液、阳性标准品、阴性对照中的至少一种。6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品通过如下方法制备得到：①从非洲猪瘟阳性样品中提取DNA；②从猪瘟病毒野毒株阳性样品中提取RNA，将RNA反转录成cDNA；③利用权利要求1和2中所述的引物分别对非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株的DNA和cDNA进行PCR扩增，得到各自的扩增产物，将得到的扩增产物与载体连接构建得到重组质粒，即为阳性标准品。7.非诊断目的的非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株的二重FQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫若潜，班付国，王淑娟，王东方，刘影，赵美雪，杨海波，刘毅，宋丹，赵雪丽，谢彩华，马震原，王翠，王华俊，刘梅芬，柴茂，王英华，
申请(专利权)人：河南省动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：河南,41