一株分泌甲拌磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株分泌甲拌磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于免疫检测领域。本发明专利技术的分泌甲拌磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45121。本发明专利技术的甲拌磷半抗原通过多次筛选和实验获得，再由该半抗原制备甲拌磷完全抗原，并以该完全抗原免疫动物获得杂交瘤细胞株，由该细胞株分泌的甲拌磷单克隆抗体对甲拌磷具有优异的亲和力和灵敏度，对甲拌磷的IC

【技术实现步骤摘要】
一株分泌甲拌磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用


[0001]本专利技术属于免疫检测
，尤其涉及一株分泌甲拌磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

技术介绍

[0002]甲拌磷[phorate，O,O
‑
二乙基
‑
S
‑
(乙硫基甲基)二硫化磷酸酯]是一种典型的广谱内吸性有机磷农药，因具有高效、低价等优势，被广泛应用于农业生产。甲拌磷是有机磷类重要的内吸性杀虫杀螨剂，属于高毒类农药，主要用于防治棉花、甜菜、小麦、高粱和油菜上的害虫，人体过量摄入会抑制胆碱酯酶活性，造成神经生理功能紊乱，危害人类身体健康。农业农村部已明确规定，禁止甲拌磷用于蔬菜、果树、茶叶及中药材生产。在甲拌磷施用过程中，未经植物吸收利用的部分会渗透进入土壤中，并长期残留。研究表明，甲拌磷在国内土壤中平均检出率高达13.72％，浓度范围为0～0.450mg
·
kg
－1
。土壤中残留的甲拌磷还会代谢产生甲拌磷砜等代谢物，该甲拌磷代谢物可以形成更高毒性的氧化物，其毒性更强、残留更久(残效期约1
‑
2个月，甚至更长)。土壤中残留的甲拌磷、甲拌磷砜还会随水转移至地表水、河流和湖泊中，形成二次污染，对生命安全造成威胁。因此，对甲拌磷残留提供一种快速有效的检测方法具有重大意义。
[0003]有关甲拌磷药物残留在动物组织中的检测方法，国内外已有少量报道，主要是用荧光光度法、气相色谱法、气相色谱
‑
串联质谱法、高效液相色谱法、液相色谱<br/>‑
串联质谱法超高效液相色谱
‑
高分辨质谱法等，检测样品主要为果蔬、茶叶、地表水和饮用水。仪器检测方法可进行定量分析并具有较低的检测限，但是通常需要昂贵的仪器和复杂的操作，前处理及检测时间长，严重制约了这些检测方法的推广。而免疫分析方法具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员相对要求低等特点，因此适用于大量样品的快速筛查。Jeffre等利用O,O
‑
二乙基
‑
O
‑
[对
‑
(4
‑
羧基丁基)苯基]硫代磷酸酯作为半抗原制得广谱特异性抗体，采用酶联免疫方法对有机磷类杀虫剂进行检测。刘贤进等采用二乙基膦酸乙酸做为通用结构半抗原制备抗血清，对毒死蜱、辛硫磷等12种常见有机磷农药具有特异性，IC
50
为0.12
‑
3.8μg/mL。魏松红等(甲拌磷残留检测间接竞争ELISA试剂盒的研制[J].食品科学,2011,32(4):284
‑
287.)研制了一种用于检测甲拌磷残留量的间接竞争ELISA试剂盒，在1
‑
5000μg/L范围内呈线性关系，检测限为4.90μg/L，IC
50
为191.37μg/L。王翀等(甲拌磷半抗原及其衍生物合成的研究[C].//第十届全国农药学科教学科研研讨会论文集.2008:238
‑
242.)以五硫化二磷与无水乙醇为原料，首先制得硫化物中间体，再添加甲醛和2
‑
巯基乙醇进行反应，得到甲拌磷半抗原，并以该半抗原为基础合成了多克隆抗体(甲拌磷人工抗原的合成及多克隆抗体制备)，检测限为6.383μg/L。谢桂勉等(硫代磷酸二乙酯类农药半抗原设计及抗体识别特性[J].高等学校化学学报,2009,30(11):2193
‑
2198.DOI:10.3321/j.issn:0251
‑
0790.2009.11.019.)以二乙氧基硫代磷酰氯及苯酚衍生物为原料制备半抗原，通过该半抗原得到的抗体构建的间接竞争ELISA方法，对于甲拌磷的IC
50
达到0.751mg/L。专利CN200810041929.3提供了一种可检测多种有机磷农药残留的抗体制备方法，对甲拌磷的
IC
50
达到0.033mg/L。专利CN201810229495.3提供了一种基于纳米抗体检测二乙氧基有机磷农药的酶联免疫试剂盒及其使用方法，以为半抗原制备抗体，将筛选出的最优抗体进一步制备成酶联免疫试剂盒，对甲拌磷的IC
50
达到3422.26mg/L；专利CN201611236387.6同样以上式所示化合物为半抗原制备抗体，筛选得到的抗体检测甲拌磷时，IC
50
达到135.7ng/L。酶联免疫法(ELISA)是一种高效、敏感、快速的检测方法，也越来越多地应用于残留物检测中，但灵敏度还需进一步提高。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术提供了对甲拌磷具有较高亲和力和检测灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株，可以用来建立甲拌磷的酶联免疫检测方法，为间接竞争ELISA试剂盒以及胶体金试纸条的研发推广奠定了基础。
[0005]本专利技术的第一个目的是提供一株分泌甲拌磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株于2022年03月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.45121。
[0006]本专利技术的第二个目的是提供一种分泌甲拌磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：
[0007]S1、将甲拌磷半抗原制备成完全抗原，采用所述完全抗原进行动物免疫；
[0008]S2、对免疫动物进行采血，对免疫动物的血清免疫效价和免疫抑制能力进行筛选；
[0009]S3、将步骤S2筛选出的免疫动物的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合培养，得到所述分泌甲拌磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
[0010]其中，所述甲拌磷半抗原的结构如下所示：
[0011][0012]进一步地，在步骤S1中，所述动物免疫过程包括首次免疫、加强免疫和冲刺免疫，首次免疫采用完全抗原和完全弗氏佐剂，加强免疫采用完全抗原和不完全弗氏佐剂，冲刺免疫采用完全抗原。
[0013]进一步地，所述动物为小鼠。
[0014]进一步地，上述甲拌磷半抗原的制备方法包括以下步骤：
[0015]S1、将式1所示化合物与乙基黄原酸盐进行反应，得到式2所示化合物；
[0016]S2、将式2所示化合物与2N KOH进行反应，酸化后得到式3所示化合物；
[0017]S3、将式3所示化合物进行酯化，得到式4所示化合物；
[0018]S4、将式4所示化合物与卤化氢进行反应，得到式5所示化合物；
[0019]S5、将式5所示化合物与O，O
‑
二甲基硫代硫代磷酸盐进行反应，得到式6所示化合物，将式6所示化合物酸化，得到所述甲拌磷半抗原；
[0020]其中，式1
‑
6所示化合物的结构如下，式中X代表卤素：
[0021][0022]进一步地，在步骤S1中，所述甲拌磷完全抗原由上述甲拌磷半抗原与载体蛋白偶联得到。
[0023]进一步地，所述载体蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株分泌甲拌磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：所述杂交瘤细胞株于2022年03月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.45121。2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在甲拌磷检测中的应用。3.一种分泌甲拌磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将甲拌磷半抗原制备成完全抗原，采用所述完全抗原进行动物免疫；S2、对免疫动物进行采血，对免疫动物进行筛选；S3、将筛选出的免疫动物的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合培养，得到所述分泌甲拌磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株；其中，所述甲拌磷半抗原的结构如下所示：4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述甲拌磷半抗原由以下步骤制备得到：S1、将式1所示化合物与乙基黄原酸盐进行反应，得到式2所示化合物；S2、将式2所示化合物与2N KOH进行反应，酸化后得到式3所示化合物；S3、将式3所示化合物进行酯化，得到式...

【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，刘杰，匡华，徐丽广，孙茂忠，吴晓玲，刘丽强，马伟，郝昌龙，宋珊珊，郭玲玲，胥欣欣，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：