【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于诊断肝细胞癌的方法
技术介绍
[0001]90％的肝细胞癌(HCC)有肝硬化基础，这通常是由于病毒性肝炎或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)引起的肝纤维化加剧所致(Zhang和Friedman，肝脏病学，56，769
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775(2012))。使用高灵敏度、排除诊断检测对肝硬化患者进行监测，这对于诊断出HCC以便进行早期治疗，从而改善预后至关重要。虽然目前的治疗标准甲胎蛋白(AFP)检测在临床确定的临界值20ng/mL下表现出高特异度(90％)，但遗憾的是，其也表现出低灵敏度(59％)(Marrero等人，胃肠病学，137，110
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118(2009))。
技术实现思路
[0002]本专利技术提供了用于诊断患者的肝细胞癌(HCC)的组合物、方法和试剂盒。特别是，本专利技术提供了甲基化细胞游离DNA生物标志物以及使用其来确定患者是否患有肝细胞癌的方法。此外，所述甲基化细胞游离DNA生物标志物可用于区分患有慢性肝病(例如肝硬化)但未患肝细胞癌的患者与患有慢性肝病且患有肝细胞癌的患者。在HCC的预后、诊断、疗法选择或监测治疗中，所述找出的生物标志物可单独使用或与一种或更多种其他生物标志物或相关临床参数组合使用。
[0003]在一方面，提供了诊断和治疗患者的肝细胞癌(HCC)的方法，所述方法包含：a)从所述患者中获取循环游离DNA(cfDNA)样本；b)检测所述cfDNA的一个或更多个基因中一个或更多个CpG位点的甲基化，其中所述一个或更多个基因选自由SPINT2、RUNX3、PRDM2、AP...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种诊断和治疗患者的肝细胞癌(HCC)的方法，所述方法包含：a)从所述患者中获取循环游离DNA(cfDNA)样本；b)检测所述cfDNA的一个或更多个基因中一个或更多个CpG位点的甲基化，其中所述一个或更多个基因选自由SPINT2、RUNX3、PRDM2、APC、GSTP1、WIF1、SEPT9、HOXA1、PFKP和AK055957组成的群组，其中来自所述患者的所述cfDNA样本中所述一个或更多个选自由SPINT2、RUNX3、PRDM2、APC、GSTP1、WIF1、SEPT9、HOXA1、PFKP和AK055957组成的群组的基因中所述一个或更多个CpG位点的甲基化频率相较于对照cfDNA样本中所述一个或更多个CpG位点的甲基化频率的参考值范围有所升高，表明所述患者的HCC诊断结果为阳性；以及c)治疗所述患者的HCC，前提是基于所述CpG位点的所述甲基化频率，所述患者的HCC诊断结果为阳性。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一个或更多个CpG位点选自cg15607538、cg08572734、cg00577935、cg03667968、cg08571859、cg02659086、cg04673590、cg09420439、cg26744375、cg08465862、cg14250130、cg00922376、cg05346841、cg26421310、cg13629563、cg06848185、cg17300544、cg22522066、cg24166864和cg26397188以及位于其200个核苷酸内的CpG位点。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述检测甲基化包含测量所述cfDNA中所述cg15607538、cg08572734、cg00577935、cg03667968、cg08571859、cg02659086、cg04673590、cg09420439、cg26744375、cg08465862、cg14250130、cg00922376、cg05346841、cg26421310、cg13629563、cg06848185、cg17300544、cg22522066、cg24166864和cg26397188CpG位点的甲基化频率。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述一个或更多个CpG位点的甲基化频率的所述参考值范围获取自一例或更多例未患HCC的对照受试者的一份或更多份血液样本中的cfDNA。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其进一步包含基于所述cfDNA的所述SPINT2、RUNX3、PRDM2、APC、GSTP1、WIF1、SEPT9、HOXA1、PFKP和AK055957基因中所述CpG位点的所述甲基化频率，使用一种或更多种算法计算HCC风险评分。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述治疗所述患者的HCC包含手术切除HCC肿瘤、行HCC肿瘤射频消融术(RFA)、行HCC肿瘤冷冻消融术、HCC肿瘤经皮乙醇或乙酸注射、经导管动脉化疗栓塞术(TACE)、选择性内照射疗法(SIRT)、肝移植、高强度聚焦超声疗法、外射束疗法、门静脉栓塞术、放射性核素疗法、化疗、靶向疗法、免疫疗法或生物疗法。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述靶向疗法包含施用索拉非尼、瑞戈非尼、仑伐替尼、卡博替尼、雷莫西尤单抗、纳武利尤单抗或帕博利珠单抗或其组合。8.根据权利要求6所述的方法，其中所述化疗包含施用顺铂、吉西他滨、奥沙利铂、多柔比星、5
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氟尿嘧啶、卡培他滨或米托蒽醌或其组合。9.根据权利要求6所述的方法，其中所述放射性核素疗法包含施用钇
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90、碘
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131、铼
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188或钬
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166。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述检测所述cfDNA中所述CpG位点的甲基化包含进行甲基化敏感性随机引物聚合酶链反应(MS AP
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PCR)、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms
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SNuPE)、甲基化特异性PCR(MSP)、甲基化敏感性DNA限制酶分析、基于限
制酶的测序、基于限制酶的微阵列分析、联合亚硫酸氢盐限制性分析(COBRA)、甲基化CpG岛扩增(MCA)、甲基化CpG岛扩增和微阵列(MCAM)、通过连接介导PCR进行的HpaII小片段富集(HELP)、亚硫酸氢盐测序、亚硫酸氢盐微阵列分析、甲基化特异性焦磷酸测序、HELP测序(HELP
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seq)、TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)、Gal水解和连接衔接子依赖性PCR(GLAD
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PCR)、甲基化DNA免疫沉淀测序(MeDIP
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Seq)、甲基化DNA免疫沉淀
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微阵列分析(MeDIP
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chip)、使用甲基敏感性限制酶的Southern印迹法或基于甲基化特异性巨磁阻传感器的微阵列分析。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述检测所述cfDNA中所述CpG位点的甲基化包含使用至少一种探针，所述探针包含选自由序列号：1
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432组成的群组的序列。12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其进一步包含测量血液中的甲胎蛋白(AFP)水平，其中检测到血液中的AFP水平以及所述一个或更多个选自由SPINT2、RUNX3、PRDM2、APC、GSTP1、WIF1、SEPT9、HOXA1、PFKP和AK055957组成的群组的基因中所述一个或更多个CpG位点的甲基化频率相较于对照受试者的血液中的AFP水平以及所述一个或更多个选自由SPINT2、RUNX3、PRDM2、APC、GSTP1、WIF1、SEPT9、HOXA1、PFKP和AK055957组成的群组的基因中所述一个或更多个CpG位点的甲基化频率的参考值范围均有所升高，表明所述患者的HCC诊断结果为阳性。13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述cfDNA样本是包含cfDNA的血液样本或血浆样本。14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述患者患有肝病。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述肝病是肝硬化、脂肪性肝病、酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、自身免疫性肝炎、药物性肝炎、病毒性肝炎、甲型肝炎病毒感染、乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、丁型肝炎病毒感染、戊型肝炎病毒感染、遗传性血色病、威尔逊氏症、原发性胆汁性肝硬化或α
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抗胰蛋白酶缺乏症。16.一种监测患者的肝细胞癌(HCC)的方法，所述方法包含：a)在第一时间点从所述患者中获取第一血液样本，稍后在第二时间点从所述患者中获取第二血液样本；以及b)检测所述第一血液样本和所述第二血液样本中循环游离DNA(cfDNA)的一个或更多个基因中一个或更多个CpG位点的甲基化，其中所述一个或更多个基因选自由SPINT2、RUNX3、PRDM2、APC、GSTP1、WIF1、SEPT9、HOXA1、PFKP和AK055957组成的群组，其中检测到所述第二血液样本的所述cfDNA中所述一个或更多个选自由SPINT2、RUNX3、PRDM2、APC、GSTP1、WIF1、SEPT9、HOXA1、PFKP和AK055957组成的群组的基因中的所述CpG位点的甲基化频率相较于所述第一血液样本的所述cfDNA有所升高，表明所述HCC正在进展，并且检测到所述第二血液样本的所述cfDNA中所述一个或更多个选自由SPINT2、RUNX3、PRDM2、APC、GSTP1、WIF1、SEPT9、HOXA1、PFKP和AK055957组成的群组的基因中的所述CpG位点的甲基化频率相较于所述第一血液样本的所述cfDNA有所降低，表明所述HCC无进展。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述HCC是原发性肿瘤、转移或复发。18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述第一时间点是在开始对所述患者的HCC进行治疗之前，并且所述第二时间点是在所述治疗期间或之后。19.根据权利要求17所述的方法，其中所述治疗是手术切除HCC肿瘤、行HCC肿瘤射频消融术(RFA)、行HCC肿瘤冷冻消融术、HCC肿瘤经皮乙醇或乙酸注射、经导管动脉化疗栓塞术
(TACE)、选择性内照射疗法(SIRT)、肝移植、高强度聚焦超声疗法、外射束疗法、门静脉栓塞术、放射性核素疗法、化疗、靶向疗法、免疫疗法或生物疗法。20.根据权利要求16至19中任一项所述的方法，其进一步包含重复步骤a)和b)。21.根据权利要求16至20中任一项所述的方法，其进一步包含增加/提高HCC治疗的剂量或频率、改用不同的治疗方案或开始对所述患者进行姑息治疗(前提是所述HCC正在进展)。22.根据权利要求16至21中任一项所述的方法，其中所述一个或更多个CpG位点选自cg15607538、cg08572734、cg00577935、cg03667968、cg08571859、cg02659086、cg04673590、cg09420439、cg26744375、cg08465862、cg14250130、cg00922376、cg05346841、cg26421310、cg13629563、cg06848185、cg17300544、cg22522066、cg24166864和cg26397188以及位于其200个核苷酸内的CpG位点。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述检测甲基化包含测量所述cfDNA中所述cg15607538、cg08572734、cg00577935、cg03667968、cg08571859、cg02659086、cg04673590、cg09420439、cg26744375、cg08465862、cg14250130、cg00922376、cg05346841、cg26421310、cg13629563、cg06848185、cg17300544、cg22522066、cg24166864和cg26397188CpG位点的甲基化频率。24.根据权利要求16至23中任一项所述的方法，其进一步包含测量血液中的甲胎蛋白(AFP)水平，其中检测到所述第二血液样本的血液中的AFP水平以及所述一个或更多个选自由SPINT2、RUNX3、PRDM2、APC、GSTP1、WIF1、SEPT9、HOXA1、PFKP和AK055957组成的群组的基因中所述一个或更多个CpG位点的甲基化频率相较于所述第一血液样本有所升高，表明所述HCC正在进展；并且检测到所述第二血液样本的血液中的AFP水平以及所述一个或更多个选自由SPINT2、RUNX3、PRDM2、APC、GSTP1、WIF1、SEPT9、HOXA1、PFKP和AK055957组成的群组的基因中所述一个或更多个CpG位点的甲基化频率相较于所述第一血液样本有所降低，表明所述HCC无进展。25.根据权利要求16至25中任一项所述的方法，其中所述检测所述cfDNA中所述CpG位点的甲基化包含进行甲基化敏感性随机引物聚合酶链反应(MS AP
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PCR)、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms
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SNuPE)、甲基化特异性PCR(MSP)、甲基化敏感性DNA限制酶分析、基于限制酶的测序、基于限制酶的微阵列分析、联合亚硫酸氢盐限制性分析(COBRA)、甲基化CpG岛扩增(MCA)、甲基化CpG岛扩增和微阵列(MCAM)、通过连接介导PCR进行的HpaII小片段富集(HELP)、亚硫酸氢盐测序、亚硫酸氢盐微阵列分析、甲基化特异性焦磷酸测序、HELP测序(HELP
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seq)、TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)、Gal水解和连接衔接子依赖性PCR(GLAD
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PCR)、甲基化DNA免疫沉淀测序(MeDIP
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Seq)、甲基化DNA免疫沉淀
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微阵列分析(MeDIP
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chip)、使用甲基敏感性限制酶的Southern印迹法或基于甲基化特异性巨磁阻传感器的微阵列分析。26.一种监测患者肝细胞癌(HCC)复发的方法，所述方法包含：a)在针对先前发生的HCC加以治疗后，在患者通过影像学或其他诊断方式表征为无癌症时，在第一时间点从所述患者中获取第一循环游离DNA(cfDNA)样本；b)检测来自所述第一cfDNA样本的cfDNA中一个或更多个生物标志物基因的启动子区内的一个或更多个CpG位点的甲基化，其中所述一个或更多个生物标志物基因选自AK055957、APC、GSTP1...
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