一种血浆中牡荆素和异牡荆素的液相色谱串联质谱检测方法技术

本发明专利技术属于生物分析技术领域，涉及一种血浆中牡荆素(Vitexin)和异牡荆素(Isovitexin)的液相色谱串联质谱检测方法。该方法包括：采用三倍含内标葛根素的乙腈溶液沉淀血浆，取上清液干燥后加入复溶溶液，混匀再离心取上清，采用液相色谱串联质谱检测牡荆素和异牡荆素的浓度；液相色谱的条件为：色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18column，2.1

【技术实现步骤摘要】
一种血浆中牡荆素和异牡荆素的液相色谱串联质谱检测方法


[0001]本专利技术属于生物分析
，涉及一种血浆中牡荆素(Vitexin)和异牡荆素(Isovitexin)的液相色谱串联质谱检测方法。

技术介绍

[0002]牡荆素和异牡荆素是两种天然植物黄酮碳苷类化合物，广泛分布于自然界的金莲花、布渣叶、山楂叶、木豆叶、夜关门、绿豆、乌蕨、柳豆叶、檀香叶及光果甘草等几十种植物中。以往一项药理学研究显示，牡荆素和异牡荆素具有抗肿瘤、抗病毒、抑菌、抗炎镇痛、抗氧化、保护心脑血管、骨保护、降低血糖、降低血压及改善神经功能等多种作用,对上述方面进行深入研究有利于肿瘤性疾病、糖尿病、心脑血管疾病、高血压病及神经疾病等疾病天然治疗药物的研究发展。考虑到牡荆素和异牡荆素具有多种的生理作用，因此有必要对牡荆素和异牡荆素的体内浓度进行检测。
[0003]由于以往牡荆素和异牡荆素药物检测具有前处理复杂、灵敏度低、分析时间长等缺点，因此需要开发一种同时测定血浆中牡荆素和异牡荆素浓度的简单高效检测方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种血浆中牡荆素和异牡荆素的液相色谱串联质谱检测方法，该方法通过简单有效的前处理方法提取血浆中的牡荆素和异牡荆素，并在较短的测定时间内准确的检测血浆样品中的牡荆素和异牡荆素。本专利技术方法极大地缩短了牡荆素和异牡荆素分析时间，整个分析过程用时只需8min；分离所需样品量极少，只需100μL左右。
[0005]本专利技术采用如下技术方案实现：
[0006]一种血浆中牡荆素和异牡荆素药物液相色谱串联质谱检测方法，包括：采用三倍含内标葛根素的乙腈溶液沉淀蛋白前处理样品，后取上清液干燥后加入复溶溶液，混匀离心取上清，采用液相色谱串联质谱检测牡荆素和异牡荆素的浓度。
[0007]本专利技术中，液相色谱条件为：色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18 column(2.1
×
100mm,3.5μm)；流动相：流动相A：含0.1％甲酸FA的水，流动相B：甲醇，梯度洗脱：0
‑
0.5min：B＝10％；0.5
‑
7.0min：B从10％升至50％；7.0
‑
7.01min：B从50％升至90％；7.01
‑
7.5min：B＝90％；7.5
‑
7.51min：B从90％降至10％；7.51
‑
8.0min：B＝10％；流速：0.3mL/min；柱温：40℃；进样量：5μL。
[0008]质谱参数为：离子源：电喷雾离子源(ESI)；离子模式：正离子模式；监测模式：多反应监测(MRM)。质谱检测器灵敏度高，分析时间短，进样量少，具有对牡荆素、异牡荆素和内标物特征离子分离和鉴定同时进行等优点，可实现体内微量牡荆素和异牡荆素药物浓度定量。
[0009]具体地，一种血浆中牡荆素和异牡荆素的液相色谱串联质谱检测方法，包括：精密移取100μL大鼠血浆，加入5μL甲醇
‑
水(1:1,v:v)，从而平行制备若干份样品；每份样品加入300μL含内标葛根素的乙腈溶液(5ng/mL)沉淀蛋白，涡旋振荡3min，13,000rpm离心10min
后，取90％上清液离心浓缩干燥，后用100μL复溶溶液(甲醇:水＝1:1，v/v)复溶，涡旋并离心后取上清液用液相色谱串联质谱进样分析，进样体积为5μL；采用液相色谱串联质谱，分别获得牡荆素和异牡荆素峰面积与内标物峰面积的比值，根据标准曲线计算血浆中牡荆素和异牡荆素的浓度。
[0010]标准曲线的获取方法，包括：精密移取若干份100μL大鼠空白血浆，分别平行精密加入5μL浓度分别为0.01、0.03、0.1、0.3、1、2、3、4μg/mL的牡荆素和异牡荆素工作溶液，制得浓度为0.5、1.5、5、15、50、100、150、200ng/mL的标准曲线样品，每份样品加入300μL含内标葛根素的乙腈溶液(5ng/mL)沉淀蛋白，涡旋振荡3min，13,000rpm离心10min后，取90％上清液离心浓缩干燥，后用100μL复溶溶液(甲醇:水＝1:1，v/v)复溶，涡旋并离心后取上清液在本实验条件下进样5μL，进行分析。所得结果以待测物浓度为横坐标，待测物峰面积为纵坐标，用加权(W＝1/X2)最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为标准曲线，牡荆素和异牡荆素线性范围为0.5
‑
200ng/mL。
[0011]本专利技术的有益效果为：
[0012](1)本专利技术利用液相色谱串联质谱技术建立了复杂生物基质血浆中目标化合物牡荆素和异牡荆素的定量检测方法，能够有效测定给予受试制剂后大鼠体内牡荆素和异牡荆素的浓度。血浆样品中牡荆素和异牡荆素样本前处理过程简单，便于操作，所用试剂常规且成本低。测定分析时间短，单次进样检测仅需8min，提高检测效率。具有前处理方法简单，检测灵敏度高，检测时间短等优点。
[0013](2)本专利技术方法对生物样本的需求样量少，只需100μL体积样本即可完成检测。
[0014](3)生物样品分析方法测定结果，线性回归方程为：牡荆素：y＝0.134447*x+0.003726(r＝0.998)，异牡荆素：y＝0.085611*x
‑
0.000907(r＝0.999)；牡荆素和异牡荆素在0.5
‑
200ng/mL浓度范围内呈线性，且线性良好；定量下限0.5ng/mL(信噪比S/N>10)；日内精密度和准确度、日间精密度和准确度、基质效应和提取回收率均符合药典中生物样品定量分析方法验证指导原则。具有线性良好，精密度高，准确度好，重现性好等特点。
附图说明
[0015]图1是牡荆素和异牡荆素的碎片离子图，其中A为牡荆素，B为异牡荆素，C为内标葛根素；
[0016]图2是大鼠血浆选择性典型色谱图；其中(A)代表空白血浆样品色谱图，(B)代表加标分析物和内标的空白血浆样品色谱图，此点配制过程为：加入5μL 0.3μg/mL牡荆素和异牡荆素工作液到100μL空白血浆中，配制成血浆终浓度为15ng/mL牡荆素和异牡荆素血浆样品，加入300μL含内标葛根素的乙腈溶液(5ng/mL)沉淀蛋白，涡旋振荡3min，13,000rpm离心10min后，取90％上清液离心浓缩干燥，后用100μL复溶溶液(甲醇:水＝1:1，v/v)复溶，涡旋并离心后取上清液用液相色谱串联质谱进样分析，进样体积为5μL，(C)代表给予受试制剂后大鼠血浆样品色谱图；峰I
‑
III分别指牡荆素、异牡荆素和内标葛根素；
[0017]图3是牡荆素和异牡荆素内标法测定标准曲线。
具体实施方式
[0018]大鼠血浆来源：SPF级SD大鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可
证及动物质量合格证号：(SCXK(沪)2017
‑
0005、20170005066418)，重本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种血浆中牡荆素和异牡荆素的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于：包括：采用三倍含内标葛根素的乙腈溶液沉淀血浆，取上清液干燥后加入复溶溶液，混匀再离心取上清，采用液相色谱串联质谱检测牡荆素和异牡荆素的浓度；其中，液相色谱的条件为：色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18 column，2.1
×
100mm,3.5μm；流动相：流动相A：含0.1％FA的水，流动相B：甲醇；梯度洗脱：0
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0.5min：B＝10％；0.5
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7.0min：B从10％升至50％；7.0
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7.01min：B从50％升至90％；7.01
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7.5min：B＝90％；7.5
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7.51min：B从90％降至10％；7.51
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8.0min：B＝10％；流速：0.3mL/min；柱温：40℃；进样量：5μL。2.根据权利要求1所述的血浆中牡荆素和异牡荆素的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于：质谱参数为：离子源：电喷雾离子源；离子模式：正离子模式；监测模式：多反应监测。3.根据权利要求1所述的血浆中牡荆素和异牡荆素的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于：所述的含内标葛...

【专利技术属性】
技术研发人员：余露山，吴革林，雷金秀，方海斌，潘杰，区凤婷，
申请(专利权)人：浙江赞生药业有限公司，
类型：发明
国别省市：