一种禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒灭活疫苗菌株的构建方法及应用技术

本发明专利技术公开一种禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒灭活疫苗菌株的构建方法及应用。本发明专利技术通过构建表达LpxE基因的重组质粒，进行电击转化到禽多杀性巴氏杆菌中，成功获得内毒素减毒菌株。本发明专利技术采用优化后的LpxE基因特异性的去除也野生型菌株上部分类脂A1位上的磷酸基团，成功改造巴氏杆菌；且内毒素致凝活性显著高于野生型菌株，表明脂多糖结构改造后内毒素毒性下降；同时，能使细胞因子IL

【技术实现步骤摘要】
一种禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒灭活疫苗菌株的构建方法及应用


[0001]本专利技术属于生物
更具体地，涉及一种禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒灭活疫苗菌株的构建方法及应用。

技术介绍

[0002]为保障食品安全，我国于2020年全面禁止在饲料中使用药物添加剂；在养殖环节则全面推行“减抗”和“限抗”模式。家禽的无抗养殖是指在家禽养殖过程中，饲料中不添加任何抗生素、激素以及其他外源性药物，将抗生素在家禽养殖中的使用严格限制在治疗疾病的范围，并完全遵循产品休药期，从而保证家禽产品中无抗生素残留。药物饲料添加剂全面退出家禽养殖行业带来的最大问题是发病率的上升，尤其是细菌性疾病，进而带来的养殖效益下降。家禽细菌性疾病中，多杀性巴氏杆菌病的流行和爆发不仅仅对动物健康产生极大的伤害，对养殖行业带来难以估量的财产损失，更大的潜在危险在于能威胁人的健康安全。
[0003]巴氏杆菌病(pasteurellosis)是由多杀性巴氏杆菌引起的一种急性、热性传染疾病。动物巴氏杆菌病的急性型常以败血症和出血性炎症为主要特征，所以过去又叫“出血性败血症”；慢性型常表现为皮下结缔组织，关节及各脏器的化脓性病灶，并多与其他疾病混合感染或继发，多杀性巴氏杆菌病在全国分布范围很广，对我国养殖业存在巨大的危害。多杀性巴氏杆菌病通常以慢性和急性形式存在，可导致显著的发病率，主要可表现为禽霍乱、猪肺疫、鼻甲骨萎缩、结膜型炎、气囊炎、关节炎和出血性红斑。在临床上，常用抗生素和疫苗来预防和治疗多杀性巴氏杆菌引起的疾病。
[0004]在国家禁抗的浪潮下，目前市面上用于预防该病的疫苗以灭活疫苗为主，但禽多杀性巴氏杆菌作为一种革兰氏阴性菌，含有大量内毒素，其灭活疫苗引起的应激反应较大，保护效果不佳。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)也叫内毒素，是革兰氏阴性细菌细胞外膜的主要组成成分，主要由类脂A、核心多糖和O
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抗原3部分组成。当病原性的革兰氏阴性细菌侵入宿主后，其表面LPS的释放并被免疫细胞表面的Toll样受体4(Toll Like Receptor 4，TLR
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4)识别，会引发细胞内一系列的生理生化反应，产生肿瘤坏死因子
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α、白细胞介素
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1β和干扰素
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γ等多种细胞因子。一方面，这些细胞因子的过量积累能够引起严重的内毒素休克，表现为炎症反应、凝血异常、血压过低、器官衰竭等症状；另一方面，部分细胞因子的适量产生可以激发宿主的免疫反应。脂多糖在禽多杀性巴氏杆菌致病过程中起有重要作用，为了降低禽多杀性巴氏杆菌疫苗的毒性，现有研究通过直接在禽多杀性巴氏杆菌基因组上缺失潜在毒力相关序列的缺失基因或进行突变，得到减毒菌株。如现有技术公开了采用天然O
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抗原不完全的大肠杆菌J5疫苗株为原始出发菌株，利用λ
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Red同源重组技术，导入外源弗朗西斯菌lpxE基因定向去除类脂A
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C1位的磷酸基团，同时缺失大肠杆菌lpxM基因从而减少一条酰基链，将大肠杆菌J5改造成可以生产低毒性MPLA的工程菌株。由于该方法仅在大肠杆菌上改造成功，能否适用于其他菌株改造还未可知，因为并不是所有菌株含有 1
位的磷酸基团，且不同菌株之间的差异较大，并且该方法还需要同时缺失lpxM 基因才能构建成功，其筛选过程繁琐，还可能存在毒力返强的风险；而采用lpxE 基因构建禽多杀性巴氏杆菌减毒菌株还鲜有研究。而在禽多杀性巴氏杆菌减毒菌株的构建基因敲除研究中，适用于基因敲除工具很少，导致多杀性巴氏杆菌基因工程弱毒菌株的开发存在一定的困难，加上市面上所用灭活疫苗存在免疫应激大的问题，因此，为了适应当前禁抗大环境下禽多杀性巴氏杆菌病预防的需要，需要对目前灭活疫苗存在的问题进行进一步的研究和开发，用于禽霍乱病的防治和应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题是克服上述问题的缺陷和不足，提供一种禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒灭活疫苗菌株的构建方法及应用。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒菌株的构建方法。
[0007]本专利技术的第二个目的是提供禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒菌株。
[0008]本专利技术的第三个目的是提供所述减毒菌株的应用。
[0009]本专利技术的第四个目的是提供一种禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒灭活疫苗。
[0010]本专利技术的第五个目的是提供所述内毒素减毒灭活疫苗的应用。
[0011]本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：
[0012]本专利技术通过对外源弗朗西斯菌LpxE基因(SEQ ID NO:1)进行密码子优化，得到优化后的LpxE基因(SEQ ID NO:2)后，分别构建两种LpxE基因重组质粒，分别转化野生型多杀性巴氏杆菌(C48
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1株)；再分别提取野生型与两种内毒素减毒菌株(原始序列和优化序列构建的)的类脂A，经过类脂A的质谱分析表明采用优化后的LpxE基因能特异性的去除野生型菌株上部分类脂A1位上的磷酸基团，并能成功改造巴氏杆菌的脂多糖结构，且优化后的LpxE基因效果更好；脂多糖结构改造后与野生型杆菌相比内毒素的毒性显著下降；通过LPS 刺激小鼠巨噬细胞并进行细胞因子测定，发现与野生型相比，内毒素减毒菌株刺激MH
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S细胞产生的细胞因子IL
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6，TNF
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α以及趋化因子CXCL2三者含量均显著下降，能大幅减少MH
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S细胞促炎因子产生。
[0013]本专利技术提供一种禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒菌株的构建方法，包括如下步骤：
[0014]S1.将SEQ ID NO:2所示的进行密码子优化后的LpxE基因序列克隆到T载体上，构建表达LpxE基因的重组质粒；
[0015]S2.将步骤S1的重组质粒转化到禽多杀性巴氏杆菌中；
[0016]S3.鉴定确认得到含有SEQ ID NO:2所示LpxE基因的禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒菌株。
[0017]优选地，采用SEQ ID NO:1所示的LpxE基因序列进行密码子优化得到SEQID NO:2所示的进行密码子优化后的LpxE基因序列。
[0018]优选地，步骤S1中克隆所用的扩增采用的引物序列如SEQ ID NO:3～4所示。
[0019]优选地，步骤S1中克隆所用的扩增条件为95℃10min；95℃15s、55℃20s、 72℃60s，40个循环；72℃7min。
[0020]优选地，步骤S1中克隆所用的扩增体系为ddH2O 20μL、2
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Phanta MaxMaster Mix 25μL、上游引物和下游引物(10μM)各2μL、模板DNA1μL。
[0021]优选地，步骤S2中禽多杀性巴氏杆菌为鸡源血清型为A:1的多杀性巴氏杆菌CVCC44801株(C48
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1株)。
[0022]本专利技术提供上述构建方本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.将SEQ ID NO:2所示的进行密码子优化后的LpxE基因序列克隆到T载体上，构建表达LpxE基因的重组质粒；S2.将步骤S1的重组质粒转化到禽多杀性巴氏杆菌中；S3.鉴定确认得到含有SEQ ID NO:2所示LpxE基因的禽多杀性巴氏杆菌内毒素减毒菌株。2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤S1中克隆所用的扩增引物序列如SEQ ID NO:3～4所示。3.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤S1中克隆所用的扩增条件为：95℃10min；95℃15s、55℃20s、72℃60s，40个循环；72℃7min。4.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤S1中克隆所用的扩增体系...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈爱华，梁昭平，冯赛祥，江金飞，梁铭治，桑运芬，周梦若，赵一珊，孙娟，张广文，许斯祺，谢倩梅，代绘琳，刘宇彤，林敏，秦苗苗，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：