柑橘黄龙病菌内参基因metG筛选和应用制造技术

本发明专利技术公开了柑橘黄龙病菌内参基因metG的筛选和应用，根据感染黄龙病的柑橘木虱和柚子转录组测序分析结果，对rpoC、Con1、Con2、clpX、ubiG、rplU、rpsA、metG、omp31、ftnA、carD、groL、B2I23_RS01640、ffh、omp/bamA等15个初步筛选出的变异系数较小的CLas候选内参基因，进行引物特异性筛选、相对表达量分析及表达稳定性评价与验证，最终确定特异性强且在不同寄主中稳定表达的内参基因metG，可应用于CLas在柑橘木虱和柑橘寄主中的基因表达研究。本发明专利技术的内参基因在CLas昆虫寄主和植物寄主中均能稳定表达，提高了黄龙病菌基因表达研究时的可靠性和稳定性，可广泛用于评估黄龙病菌基因在不同寄主中表达量分析，且筛选出的9对特异性内参引物也可用于柑橘黄龙病的qPCR检测鉴定，具有重要的应用价值。有重要的应用价值。有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
柑橘黄龙病菌内参基因metG筛选和应用


[0001]本专利技术涉及分子植物病理学
，尤其涉及柑橘黄龙病菌内参基因metG筛选和应用。

技术介绍

[0002]柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)是一种由革兰氏阴性细菌
‑
韧皮部杆菌('Candidatus Liberibacter')侵染引起的检疫性病害，该病原菌可在柑橘和传病媒介昆虫柑橘木虱(Diaphorina citri Kuwayama)体内繁殖，且在木虱体内增殖更快。基于病原菌的热敏感性、分布区域、传播媒介的种类和16SrDNA序列信息，将柑橘黄龙病菌分为韧皮部杆菌亚洲种('Candidatus Liberibacter asiaticus',CLas)、非洲种('Candidatus Liberibacter africanum',CLaf)和美洲种('Candidatus Liberibacter americanum',CLam)。目前公认的我国主要为韧皮部杆菌亚洲种。HLB主要通过带病苗木和柑橘木虱传播，几乎可侵染所有的柑橘类植物，对世界柑橘产业造成破坏性的影响，其破坏力已远远超过其它任何柑橘病害，最近的研究结果显示柑橘黄龙病是一种韧皮部杆菌触发的免疫性疾病。
[0003]反转录实时荧光定量PCR(RT
‑
qPCR)是基因表达研究常用的方法，具有极高的检测灵敏性和特异性。有研究通过RT
‑
qPCR对黄龙病菌效应子基因在柑橘寄主中和木虱寄主中的表达量进行分析，结果表明不同寄主中存在显著差异。如CLIBASIA_00460效应子基因仅在柑橘中大量表达，而CaLasSDE115效应子基因在木虱中表达量显著高于柑橘等。这些差异表达的基因预示着在不同的寄主中分别有着不同的重要功能。在基因表达量分析中，内参基因选择的优劣直接影响结果的准确性。而特异性强且稳定表达的内参基因可有效通过标准化/归一化校正RNA提取和cDNA合成过程中带来的偏差，进而确保RT
‑
qPCR实验结果的准确性，使不同样本之间目的基因的比较成为可能。而且不同黄龙病感病柑橘样品和木虱样品中CLas的病菌含量也不相同，寄主植物/昆虫的内参基因不能矫正由于病菌含量不同产生的偏差，必须经合适的黄龙病菌内参基因先进行归一化，才可进行样本间的比较，否则将会得到完全错误的基因表达信息。理想的病原菌内参基因应该在各种实验条件下、在不同寄主中、在不同组织和细胞中均能稳定表达，然而，近些年来文献报道中关于黄龙病菌的内参基因大多都有不足之处，很多都不适用于跨寄主分析，只适合在寄主植物中使用或者寄主昆虫中使用。此外，在黄龙病菌体内大部分基因都并非高表达，若使用黄龙病常用的多拷贝超高表达的16SrDNA、rplJ或线粒体细胞色素氧化酶COX基因作为内参校准黄龙病菌体内低表达基因将会引入较大的误差。故在CLas的RT
‑
qPCR基因表达研究中，选择与预期Cq或Ct值更接近目标基因的内参基因是首选。此外，常用于分子或血清学检测靶标的omp/bamA基因也常作为内参，但未见对其在不同寄主中的表达稳定性进行评估。因此筛选CLas在植物和昆虫两类寄主中都稳定表达的且非超高表达的内参基因就显得尤为重要。

技术实现思路

[0004]基于
技术介绍
存在的技术问题，本专利技术提出了柑橘黄龙病菌内参基因metG筛选和应用，该基因可用于同时研究黄龙病菌基因在柑橘木虱和柑橘中表达分析。
[0005]本专利技术提出的柑橘黄龙病菌内参基因metG，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0006]本专利技术提出的柑橘黄龙病菌内参基因metG在研究黄龙病菌在昆虫寄主柑橘木虱和植物寄主柑橘中的基因表达分析中的应用。
[0007]本专利技术提出的柑橘黄龙病菌内参基因metG的筛选，方法步骤如下：
[0008]S1：通过多样本转录组数据分析，筛选表达量相对较高的基因，并筛选变异系数较小的基因作为候选基因；
[0009]S2：进行引物特异性筛选，去除特异性不佳的候选基因；
[0010]S3：根据不同黄龙病菌内参候选基因RT
‑
qPCR结果得到的Cq或Ct值，依次采用不同单一内参对所有候选内参基因进行数据归一化，然后使用在线工具RefFinder并结合geNorm、Normfinder、BestKeeper和Delta CT四种分析方法，综合分析黄龙病感病柑橘木虱和柚子中病原菌候选内参基因的稳定性；
[0011]S4：结合候选基因相对表达量、表达稳定性评价，以及进行最佳内参验证，最终筛选获得最优内参基因。
[0012]优选地，内参基因的相对表达量采用2
‑
ΔCq
法计算。
[0013]优选地，所述内参基因metG的引物如SEQ ID NO.4
‑
5所示。
[0014]本专利技术提出的柑橘黄龙病菌内参基因metG在黄龙病qPCR或RT
‑
qPCR检测试剂盒中的应用。
[0015]本专利技术提出的内参基因metG的引物在制备黄龙病qPCR或RT
‑
qPCR检测试剂盒中的应用。
[0016]本专利技术提出的黄龙病qPCR或RT
‑
qPCR检测试剂盒，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的内参基因metG、如SEQ ID NO.4
‑
5所示的对应引物。
[0017]本专利技术的有益技术效果：
[0018](1)本专利技术的metG内参基因适用于柑橘黄龙病菌在昆虫寄主柑橘木虱和植物寄主柑橘中的基因表达研究，使柑橘黄龙病菌在植物寄主和昆虫寄主中目的基因的比较成为可能；弥补了大多数已报道文献中仅适用于植物寄主的黄龙病菌内参基因的不足。
[0019](2)本专利技术优化了内参稳定性评价流程，评估前先依次用候选基因作为内参对Cq或Ct值进行归一化处理，再通过计算的2
‑
ΔCq
对内参稳定性进行综合评价，最大限度的减小由于各植物样品和昆虫样品中含菌量差异带来的偏差。
[0020](3)本专利技术的metG内参基因与现有常用的外膜蛋白基因omp/bamA基因相比，在寄主中具有更高的表达量，减少了误差的产生。
附图说明
[0021]图1为本专利技术提出的柑橘黄龙病菌内参基因筛选所用的感病柑橘木虱和柚子黄龙病样品PCR检测电泳图；Marker：DL2000 DNAmarker；YZ1
‑
YZ5：感病柚子样品；Psy1
‑
Psy5：感病木虱样品；阳性：黄龙病正对照；阴性：健康柑橘；水：无模板水对照。
[0022]图2为本专利技术提出的9个特异性柑橘黄龙病菌内参基因的qPCR溶解曲线；A：metG；
B：rpsA；C：omp31；D：ftnA；E：carD；F：groL；G：B2I23_RS01640；H：ffh；I：omp/bamA。
[0023]图3为本专利技术提出本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.柑橘黄龙病菌内参基因metG，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.如权利要求1所述的柑橘黄龙病菌内参基因metG在研究黄龙病菌在昆虫寄主柑橘木虱和植物寄主柑橘中的基因表达分析中的应用。3.如权利要求1所述的柑橘黄龙病菌内参基因metG的筛选，其特征在于，方法步骤如下：S1：通过多样本转录组数据分析，筛选表达量相对较高的基因，并筛选变异系数较小的基因作为候选基因；S2：进行引物特异性筛选，去除特异性不佳的候选基因；S3：根据不同黄龙病菌内参候选基因RT
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qPCR结果得到的Cq或Ct值，依次采用不同单一内参对所有候选内参基因进行数据归一化，然后使用在线工具RefFinder并结合geNorm、Normfinder、BestKeeper和Delta CT四种分析方法，综合分析黄龙病感病柑橘木虱和柚子中病原菌候选内参基因的稳定性；S4：结合候选基因相对表达量、表达稳定性评价，以及进行最佳内...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏华楠，李利娜，王凯丽，钟八莲，黄爱军，
申请(专利权)人：赣南师范大学，
类型：发明
国别省市：