一种丝状真菌复制子制造技术

本发明专利技术公开了一种丝状真菌复制子，所述复制子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述复制子是以19种真菌基因组为模板构建宏基因组文库，转化黑曲霉孢子筛选得到，来自厚孢根霉内生菌伯克霍尔德氏菌HKI454基因组。本发明专利技术的复制子可以在黑曲霉表达系统中发挥复制功能，并且可以提供比AMA1复制子更高的稳定性，为首次在除构巢曲霉以外的真菌中发现的复制子，丰富了复制子元件库，拓展了丝状真菌利用复制子的选择多样性。的选择多样性。的选择多样性。

【技术实现步骤摘要】
一种丝状真菌复制子


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种丝状真菌复制子。

技术介绍

[0002]在真菌自主复制序列未被发现之前，丝状真菌转化系统最主要的缺陷是没有类似于可以在酵母菌染色体外自主复制的质粒，导致整合转化的效率低下。自研究人员在酿酒酵母中发现ARS序列以来，关于复制子的研究在真菌中展开，最早在构巢曲霉中发现一段6.1Kb的序列AMA1，含有AMA1序列的质粒转化构巢曲霉可以将转化效率提高250倍，并且可以在染色体外自主复制，该序列也被应用于其他真菌，如产黄青霉、黑曲霉、寄生曲霉等。从1991年AMA1序列发现至今，有关丝状真菌的自主复制序列研究进展缓慢，因此筛选潜在的真菌复制子可为合成生物学的发展提供一定的参考价值。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种丝状真菌复制子R75flank3.441，所述复制子是以19种真菌基因组为模板构建宏基因组文库，转化黑曲霉孢子筛选得到，来自厚孢根霉内生菌伯克霍尔德氏菌HKI454基因组。
[0004]本专利技术提供的丝状真菌复制，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0005]所述复制子R75flank3.411的构建方法如下：
[0006]1)以AnEp8
‑
AnHyg质粒为模板，经Not I酶切除去AMA1复制子得到AnEp8
‑
AnHyg
‑
deleteAMA1载体；以19种真菌混合基因组为模板，经Tn5建库试剂盒进行DNA片段化处理，Altama
‑
F/R引物扩增筛选4
‑
5Kb目的片段，将扩增产物回收并纯化；将AnEp8
‑
AnHyg
‑
deleteAMA1线性载体与目的片段使用In
‑
fusion法连接并转化至10β超级感受态细胞，提取质粒备用；
[0007]2)利用HDEN技术将步骤1)得到的质粒转化至黑曲霉孢子，Hyg抗性基因筛选到一个阳性转化子，以所述阳性转化子孢子为模板，Not I
‑
F/R引物验证，sanger测序得到一段R75序列，包含部分核糖体大亚基蛋白L9和DNA复制解旋酶序列；
[0008]3)以19种真菌基因组为模板，R75
‑
F/R引物扩增得出R75序列来源，以R75序列来源为模板，R75flank
‑
F/R扩增得到R75flank3.441片段，与步骤1)中的AnEp8
‑
AnHyg
‑
deleteAMA1连接得到AnEp8
‑
R75flank3.441质粒。
[0009]本专利技术的有益效果在于：本专利技术的R75flank3.441复制子可以在黑曲霉表达系统中发挥复制功能，并且可以提供比AMA1复制子更高的稳定性，为首次在除构巢曲霉以外的真菌中发现的复制子，丰富了复制子元件库，拓展了丝状真菌利用复制子的选择多样性。
附图说明
[0010]图1是不同扩增循环数、Tn5用量以及处理时间对目的片段的影响；
[0011]M：Takara 250bp DNA Ladder Marker；(A)泳道1
‑
5：扩增循环数分别为15、20、25、
30、35；(B)泳道1
‑
2：Tn5用量分别为0.05U和0.03U；(C)泳道1
‑
5：片段化处理时间分别为10sec、15sec、20sec、25sec、30sec。
[0012]图2是Tn5文库菌落PCR验证。
[0013]图3是Tn5文库黑曲霉菌落PCR验证。
[0014]图4是R75序列。
[0015]图5是PCR验证R75片段来源电泳图；
[0016]M：Takara DL500 DNA Ladder Marker；(A)泳道1
‑
10模板分别为：GDMCC 3.605、CICC 40344、GDMCC 3.515、GDMCC 3.439、GDMCC 3.441、GDMCC 3.549、GDMCC 3.521、GDMCC 3.510、CICC 40341、CBS 513.88；(B)泳道1
‑
9模板分别为：ATCC 24919、GDMCC 3.405、CICC 40359、GDMCC 3.97、GDMCC 3.548、CICC 2397、GDMCC 2.12、GDMCC 3.413、GDMCC 3.503。
[0017]图6是R75flank3.441/3.405片段扩增(A)及AnEp8
‑
R75flank3.441/3.405质粒转化子验证(B)；
[0018]其中，M：Takara 250bp DNA Ladder Marker；(A)泳道1:R75flank3.405；泳道2:R75flank3.441片段.(B)泳道1
‑
2模板：AnEp8
‑
R75flank3.441两个转化子；泳道3模板：AnEp8
‑
R75flank3.405一个转化子。
[0019]图7是R75flank3.441序列。
[0020]图8是Actin和Hyg基因熔解峰图。
[0021]图9是两种样品的Hyg基因相对表达量比例图。
[0022]图10是两种黑曲霉转接PDA若干次后潮霉素验证；
[0023]M：Takara 250bp DNA Ladder Marker；(A)泳道1
‑
9：AnEp8
‑
AnHyg黑曲霉转接1
‑
9次；泳道10：阴性对照；(B)泳道1
‑
9：AnEp8
‑
R75flank3.441黑曲霉转接1
‑
9次；泳道10：阴性对照。
[0024]图11是两种质粒连接4Kb外源片段菌落PCR验证；
[0025]M：Takara 250bp DNA Ladder Marker；(A)1
‑
5:AnEp8
‑
AnHyg质粒；6:阴性对照.(B)1
‑
5:AnEp8
‑
R75flank3.441质粒。
[0026]图12是两种质粒连接10Kb外源片段菌落PCR验证；
[0027]M：Takara 250bp DNA Ladder Marker；(A)1
‑
5:AnEp8
‑
AnHyg质粒；6:阴性对照.(B)1
‑
5:AnEp8
‑
R75flank3.441质粒；6:阴性对照.
[0028]图13是两种质粒连接16Kb外源片段菌落PCR验证；
[0029]M：Takara 250bp DNA Ladder Mark本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种丝状真菌复制子，其特征在于，所述复制子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.如权利要求1所述的一种丝状真菌复制子的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1）以AnEp8
‑
AnHyg质粒为模板，经Not I酶切除去AMA1复制子得到AnEp8
‑
AnHyg
‑
deleteAMA1载体；以19种真菌混合基因组为模板，经Tn5建库试剂盒进行DNA片段化处理，Altama
‑
F/R引物扩增筛选4
‑
5 Kb目的片段，将扩增产物回收并纯化；将AnEp8
‑
AnHyg
‑
deleteAMA1线性载体与目的片段使用In
‑
fus...

【专利技术属性】
技术研发人员：林峻，燕天鹤，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：