一种潜艇金属探测元件及其构建的电化学探测传感器和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种潜艇金属探测元件及其构建的电化学探测传感器和应用。所述潜艇金属探测元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示或者如SEQ ID NO.3所示，具有显著提高潜艇释放金属Ni

【技术实现步骤摘要】
一种潜艇金属探测元件及其构建的电化学探测传感器和应用


[0001]本专利技术属于分子生物学及微生物传感
，具体涉及一种潜艇金属探测元件及其构建的电化学探测传感器和应用。

技术介绍

[0002]潜艇作为现代海军的重要组成部分，具有隐蔽性高、打击力强的特点，是一种十分具有威胁的海洋战争武器。因此实现我国海岸线周边活动潜艇的高效准确探测，对于我国海洋国防安全具有重要战略意义。当前潜艇探测方法主要分为声呐探潜和非声探潜。然而，传统的探潜方式均存在一定的局限性，比如易于暴露、干扰大等。近年来，随着现代微生物学及分子生物学技术的迅猛发展，以微生物为基础的生物传感器技术受到了广泛的关注。因此，基于潜艇舰体及循环水管道释放的金属离子检测的微生物传感器的开发具有重要前景。通过对潜艇合金组成及海水中金属离子分析发现，潜艇合金中含金属镍，而海水中几乎不含该金属元素，因此金属Ni
2+
可作为潜艇金属离子的生物传感器的诱导物。目前，开发用于检测潜艇金属离子的生物传感器的主要挑战是实现高灵敏度和高选择特异性。
[0003]恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)是一种革兰氏阴性杆菌，在自然界中分布很广泛，其在不同环境中常具有不同的代谢模式。该菌曾被报道对多种金属具有一定的耐受性，同时在重金属污染的环境修复中能够起到一定的作用。这说明该菌株基因组含有可高效感应金属离子的相关启动子元件等。基于此进行响应潜艇金属Ni
2+
的启动子元件筛选尚无报道。同时，希瓦氏菌作为一种重要的电化学应用模式菌株，通过感应金属离子启动子元件表达核黄素合成基因簇，能够实现核黄素和黄素腺嘌呤二核苷酸的合成增加，提高电子传递介质介导胞外电子传递效率的同时，能够促进该菌在电极表面生物膜的形成，间接提高胞外电子传递效率。因此，本专利技术通过构建恶臭假单胞菌启动子文库筛选的方法进行响应潜艇金属Ni
2+
的启动子元件筛选，并通过构建希瓦氏菌电化学探测传感器实现对潜艇金属Ni
2+
离子的检测。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种潜艇金属探测元件及其构建的电化学探测传感器和应用。本专利技术通过构建恶臭假单胞菌启动子文库的方法，筛选到高效感应金属Ni
2+
的潜艇金属探测元件，并将潜艇金属探测元件转录表达核黄素合成的核心基因簇(ribADEH
‑
C)，提高电子传递介质介导的胞外电子传递效率，实现了希瓦氏工程菌感应金属Ni
2+
离子后电化学信号的输出，构建了一种金属Ni
2+
离子的微生物电化学探测传感器。
[0005]为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：
[0006]本专利技术提供了一种潜艇金属探测元件，所述潜艇金属探测元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示或者如SEQ ID NO.3所示。
[0007]进一步的，所述潜艇金属探测元件来源于恶臭假单胞菌，是利用恶臭假单胞菌启动子文库筛选得到的。
[0008]进一步的，利用启动子文库筛选到的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的潜艇金属探测元件P1‑
10
能够以高灵敏度响应金属Ni
2+
离子。
[0009]进一步的，由所述潜艇金属探测元件P1‑
10
经定向进化优化后，得到的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的元件P1‑
10
‑1对潜艇金属Ni
2+
离子的响应灵敏度显著提高。
[0010]本专利技术还提供了含有所述的潜艇金属探测元件的电化学探测传感器，所述电化学探测传感器中同时包括潜艇金属探测元件、核黄素合成核心基因簇片段。
[0011]进一步的，所述核黄素合成核心基因簇片段为核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的ribADEH基因片段和核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的ribC基因片段。
[0012]本专利技术还提供了所述的电化学探测传感器的制备方法，包括以下步骤：
[0013](1)对提取的恶臭假单胞菌基因组DNA进行不完全酶切，回收得到基因组酶切产物，获得启动子文库；
[0014](2)将步骤(1)中的启动子文库与荧光报告基因连接转化后，进行验证筛选，将得到的重组菌株涂布于含有一定浓度Ni
2+
的LB固体平板上，先利用平板荧光观察法进行初筛，初筛得到的菌株再利用微孔板酶标仪荧光光度测定法进行复筛，获得具有明显荧光信号的菌株，该菌株所携带的启动子即为响应Ni
2+
的潜艇金属探测元件；
[0015](3)将该响应Ni
2+
离子的潜艇金属探测元件利用易错PCR进行定向进化，得到的数个单菌落再分别进行平板荧光观察法初筛和酶标仪复筛，最终筛选得到检测效果更强的潜艇金属探测元件；
[0016](4)将步骤(3)的潜艇金属探测元件与黄素合成的核心基因簇(ribADEH
‑
C)连接，克隆至表达载体pYYDT，获得重组表达质粒pYYDT
‑
P
‑
ribADEH
‑
ribC
‑
P；
[0017](5)将步骤(4)中的重组表达质粒pYYDT
‑
P
‑
ribADEH
‑
ribC
‑
P接合转移至希瓦氏菌，获得重组工程菌Sone(pYYDT
‑
P
‑
ribADEH
‑
ribC
‑
P)，即为电化学探测传感器。
[0018]进一步的，所述荧光报告基因为绿色荧光蛋白基因eGFP，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0019]本专利技术还提供了所述的潜艇金属探测元件在用于制备检测潜艇金属离子的表达盒、试剂盒或制剂中的应用。
[0020]进一步的，检测所述潜艇金属离子的浓度不低于0.1μmol/L。
[0021]本专利技术还提供了所述的潜艇金属探测元件或者所述的电化学探测传感器在用于制备实时检测潜艇的电化学装置中的应用。
[0022]进一步的，所述电化学装置是利用碳毡、Ag/AgCl校正电极与含有潜艇金属探测元件的工程菌或者电化学探测传感器共同组成的。
[0023]进一步的，所述电化学装置检测到潜艇释放的金属Ni
2+
离子时，其电化学信号输出会出现明显提高；当潜艇离开后，所述电化学装置的电化学信号输出会恢复平稳状态。
[0024]本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
[0025]本专利技术通过利用恶臭假单胞菌基因组构建启动子文库，筛选感应金属Ni
2+
的启动子元件，并通过定向进化进一步提高其检测灵敏度，得到的启动子元件P1‑
10
‑1具有显著提高金属Ni
2+
检测灵敏度的能力，且筛选方法本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种潜艇金属探测元件，其特征在于，所述潜艇金属探测元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示或者如SEQ ID NO.3所示。2.含有权利要求1所述的潜艇金属探测元件的电化学探测传感器，其特征在于，所述电化学探测传感器中同时包括潜艇金属探测元件、核黄素合成核心基因簇片段。3.根据权利要求2所述的电化学探测传感器，其特征在于，所述核黄素合成核心基因簇片段为核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的ribADEH基因片段和核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的ribC基因片段。4.权利要求2或3所述的电化学探测传感器的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)对提取的恶臭假单胞菌基因组DNA进行不完全酶切，回收得到基因组酶切产物，获得启动子文库；(2)将步骤(1)中的启动子文库与荧光报告基因连接转化，利用金属Ni
2+
离子进行荧光检测验证，筛选得到响应Ni
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离子的潜艇金属探测元件；(3)将步骤(2)的潜艇金属探测元件与核黄素合成核心基因簇片段连接，融合、克隆至表达载体中，得到含...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨建明，马冉，王兆宝，李美洁，汤若昊，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：