Pa22基因作为负调控因子在提高成团泛菌合成草欧菌素A产量中的应用制造技术

本发明专利技术公开了Pa22基因作为负调控因子在提高成团泛菌合成草欧菌素A产量中的应用，所述Pa22基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述应用的途径为破坏Pa22基因的功能，来提高成团泛菌合成草欧菌素A的产量。本发明专利技术基于上述应用获得了一株可高产草欧菌素A的成团泛菌工程菌ZJU23

【技术实现步骤摘要】
Pa22基因作为负调控因子在提高成团泛菌合成草欧菌素A产量中的应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及Pa22基因作为负调控因子在提高成团泛菌合成草欧菌素A产量中的应用。

技术介绍

[0002]草欧菌素A(Herbicolin A)是由成团泛菌(Pantoea agglomerans)ZJU23产生的一种次生代谢产物。草欧菌素A对稻瘟病菌、禾谷镰刀菌、灰葡萄孢等植物病原真菌以及白色念珠菌、烟曲霉等人体条件致病菌均具有抑制效果。草欧菌素A具有独特的抑菌机制，其可通过结合禾谷镰刀菌细胞膜上的麦角甾醇，破坏膜上脂筏的结构，从而发挥抑菌活性，可作为良好的生物源农药用于生物防治。草欧菌素A的结构式如式 (1)所示，其具有许多优点，但是其生产成本巨大，所以提高其产量成为降低其生产成本的核心问题。
[0003][0004]目前，生产草欧菌素A的方法主要为微生物发酵法，目前尚未有报道通过化学合成法获得草欧菌素A。微生物发酵法主要是通过微生物发酵获得草欧菌素A，具有工艺相对简单、环境友好、条件温和和成本低等优势。
[0005]然而，现有的生物法也仍存在一定的缺陷，其中，产量不高是阻碍微生物发酵法工业化进程最主要的缺陷。因此，急需找到一株可高产草欧菌素A的微生物以克服上述缺陷。
[0006]目前提高细菌次生代谢产物产量的方法主要有优化发酵条件，基因突变筛选高产菌株，代谢工程等。负责草欧菌素A生物合成的相关基因在成团泛菌ZJU23的基因组上成簇分布。迄今为止，涉及草欧菌素A生物合成途径中相关转录调控因子及其调控机制的研究仍旧很少。

技术实现思路

[0007]本专利技术提供了Pa22基因作为负调控因子在提高成团泛菌合成草欧菌素A产量中的新用途，并据此获得破坏Pa22基因功能后的成团泛菌基因工程菌，将其发酵来生产草欧菌素A，显著提高了成团泛菌草欧菌素A的产量。
[0008]具体技术方案如下：
[0009]本专利技术提供了Pa22基因作为负调控因子在提高成团泛菌合成草欧菌素A产量中的应用，所述Pa22基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述应用的途径为破坏 Pa22基因的功能，来提高成团泛菌合成草欧菌素A的产量。
[0010]在本专利技术的研究中，挖掘到与草欧菌素A基因簇转录负调控相关的基因Pa22，敲除这个调控蛋白基因，可以显著提高草欧菌素A的产量。
[0011]Pa22基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，该基因共编码341个氨基酸，是一个LacI家族转录调控因子，在细菌的运动、毒力、次生代谢等方面发挥作用，能够调控许多基因表达；破坏Pa22基因功能的方式可以是多种的，例如：基因敲除，基因沉默等。
[0012]进一步地，所述应用的途径为通过敲除成团泛菌的Pa22基因，来提高成团泛菌合成草欧菌素A的产量。
[0013]更进一步地，所述成团泛菌为成团泛菌(Pantoea agglomerans)ZJU23，菌株保藏编号为CGMCC No.16174，保藏日期为2018年7月30日。
[0014]本专利技术还提供了一种成团泛菌基因工程菌，所述成团泛菌基因工程菌为Pa22基因被敲除的成团泛菌(Pantoea agglomerans)ZJU23；所述Pa22基因的核苷酸序列如 SEQ ID No.1所示。
[0015]进一步地，所述基因工程菌内还包含质粒pKD46。
[0016]敲除原理是：将含有目的基因上下游50bp同源臂的抗性片段转入宿主细胞ZJU23 中，在质粒pKD46表达的重组酶的帮助下，通过同源重组的方式，对目的基因进行敲除。
[0017]本专利技术还提供了成团泛菌基因工程菌在提高草欧菌素A产量中的应用，所述成团泛菌基因工程菌如上文所述。
[0018]本专利技术还提供了一种生产草欧菌素A的方法，包括：将成团泛菌基因工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，获得含有草欧菌素A的发酵液；将含有草欧菌素A的发酵液进行分离，获得草欧菌素A；
[0019]所述成团泛菌基因工程菌如上文所述。
[0020]进一步地，所述发酵的温度为25～30℃、转速为150～200rpm。更进一步地，所述发酵的温度为25℃、转速为180rpm。
[0021]进一步地，所述发酵培养基为KB液体培养基；所述KB液体培养基的成分包含蛋白胨8～12g/L、甘油13～16g/L、磷酸氢二钾1.2～1.6g/L、硫酸镁0.4～0.8g/L。
[0022]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0023]本专利技术发现了Pa22基因作为负调控因子在提高成团泛菌合成草欧菌素A产量中的新用途，并基于该发现获得了一株可高产草欧菌素A的成团泛菌工程菌 ZJU23
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Pa22，此成团泛菌工程菌ZJU23
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Pa22是通过敲除成团泛菌ZJU23中的Pa22基因获得的，将此成团泛菌工程菌ZJU23
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Pa22接种至KB液体培养基中发酵72h，即可使发酵液中草欧菌素A的产量高达116.6mg/L，是野生型成团泛菌ZJU23的1.33倍。
附图说明
[0024]图1为Pa22基因的敲除原理示意图；
[0025]其中，Pa22
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F、Pa22
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R为含有Pa22基因上下游50bp同源臂的引物，用于扩增卡那抗性基因序列；Pa22
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ID
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F、Pa22
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ID
‑
R为验证Pa22基因是否敲除的引物，引物分别设计在50bp同源臂上游以及卡那抗性基因片段上，若Pa22基因被敲除，能扩增出大小为1008bp的条带；Pa22
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N
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F、Pa22
‑
N
‑
R为Pa22基因内部序列，若Pa22基因未被敲除，则能够扩增出大小为622bp的条带，因此，Pa22基因敲除突变体无法扩增出条带，ZJU23野生型菌株能够扩增出对应大小的条带；Km为卡那抗性基因序列。
[0026]图2为Pa22基因敲除株的菌落PCR鉴定图；
[0027]其中，ID即代表用引物Pa22
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ID
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F、Pa22
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ID
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R进行PCR验证，IN即代表用引物 Pa22
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N
‑
F、Pa22
‑
N
‑
R进行PCR验证。Pa22
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1为Pa22基因敲除株1的条带，Pa22
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2为 Pa22基因敲除株2的条带，Pa22
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3为Pa22基因敲除株3的条带，三个菌株为不同的转化子；ZJU23为成团泛菌ZJU23的PCR扩增条带；Negative control为阴性对照，即 PCR时未加入DNA模板，Marker为购自Takara的250bp DNA 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.Pa22基因作为负调控因子在提高成团泛菌合成草欧菌素A产量中的应用，其特征在于，所述Pa22基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述应用的途径为破坏Pa22基因的功能，来提高成团泛菌合成草欧菌素A的产量。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用的途径为通过敲除成团泛菌的Pa22基因，来提高成团泛菌合成草欧菌素A的产量。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述成团泛菌为成团泛菌(Pantoea agglomerans)ZJU23，菌株保藏编号为CGMCC No.16174，保藏日期为2018年7月30日。4.一种成团泛菌基因工程菌，其特征在于，所述成团泛菌基因工程菌为Pa22基因被敲除的成团泛菌(Pantoea agglomerans)ZJU23；所述Pa22基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。5.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪宏凯，陈云，马忠华，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：