一种单链核酸分子测序文库构建方法技术

本发明专利技术涉及一种单链核酸分子测序文库构建方法。本发明专利技术有效实现了基于单链核酸分子构建测序文库，流程简单快速，避免了繁琐的纯化程序，且使用茎环接头能够有效减少接头二聚体产生，另外，该测序文库得率更高，成本低，包含信息丰富，能够有效地获得更全面的测序信息，为后续分析提供更有利的支持。为后续分析提供更有利的支持。为后续分析提供更有利的支持。

【技术实现步骤摘要】
一种单链核酸分子测序文库构建方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体的，本专利技术涉及核酸测序领域，更具体的，本专利技术涉及一种单链核酸分子测序文库构建方法、测序文库、测序方法、试剂盒以及游离核酸测序方法。

技术介绍

[0002]与一代测序Sanger法相比，高通量测序技术在处理大规模样品时具有显著优势，是目前基因组学研究中的核心技术。在进行高通量测序之前，需要完成测序文库制备，而测序文库是未知序列的待测核酸至少一端带上接头序列的核酸库。针对双链核酸分子，测序平台已经提供了各种不同的文库构建方法，但双链核酸分子建库流程并不适用于单链核酸分子建库，因此，本专利技术提出新的针对单链核酸分子的测序文库构建方法。

技术实现思路

[0003]专利技术人发现，测序研究的DNA分子对象，有时候不止含有双链DNA，还可能含有单链DNA分子。比如在检测循环肿瘤DNA(ctDNA)领域，血浆中的ctDNA除了为受损的双链DNA，也含有不少单链DNA；又比如石蜡包埋(FFPE)样品，也含大量的单链断裂DNA；另外在甲基化建库过程中，双链DNA进行重亚硫酸盐转化后会发生降解变性产生单链DNA等。单链核酸分子并不能使用现有的双链核酸分子建库测序方法进行测序文库构建。
[0004]本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术提出了一种通过采用茎环接头针对单链核酸分子构建测序文库的方法。
[0005]在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种单链核酸分子测序文库构建方法，在一些实施方式中，该方法包括以下步骤：(1)使单链核酸分子的两端分别与第一茎环接头和第二茎环接头进行连接，以便获得连接产物；和(2)对步骤(1)所述连接产物进行扩增处理，以便获得扩增产物，所述扩增产物携带测序引物区，所述扩增产物构成所述测序文库，其中，所述第一茎环接头具有：第一单链简并序列区，所述第一单链简并序列区位于所述第一茎环接头的5
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端；第一双链区，所述第一双链区与所述第一单链简并序列区远离所述第一茎环接头的5
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末端的一侧相连；和第一单链环区，所述第一单链环区的两个末端分别与所述第一双链区远离所述第一单链简并序列区一侧的两个末端相连，所述第二茎环接头具有：第二单链简并序列区，所述第二单链简并序列区位于所述第二茎环接头的3
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端；第二双链区，所述第二双链区与所述第二单链简并序列区远离所述第二茎环接头的3
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末端的一侧相连；和第二单链环区，所述第二单链环区的两个末端分别与所述第二双链区远离所述第二单链简并序列区一侧的两个末端相连。
[0006]在一些实施方式中，由于第一茎环接头和第二茎环接头分别具有单链简并序列区，因此，可以和单链核酸分子的两端分别形成双链结构，进一步，可以采用常见的双链DNA连接酶，例如T4DNA连接酶就能够实现在单链核酸分子的两侧分别连接茎环接头，有效地降低了连接酶的成本，提高了连接茎环接头的效率。其中，通过采用茎环结构，可以降低茎环
接头之间的互连或者自连。另外，在获得连接产物后，通过扩增处理，可以在连接产物的两端引入其他的核酸序列，例如测序引物区，由此，获得了可以用于单链核酸分子测序的测序文库，有效地实现了基于单链核酸分子构建测序文库。
[0007]在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种测序文库，其是通过以上所述的方法获得的。
[0008]在本专利技术的第三方面，本专利技术提出了一种测序方法。在一些实施方式中，该方法包括：根据以上所述的方法构建测序文库；和对所述测序文库进行测序。
[0009]在本专利技术的第四方面，本专利技术提出了一种用于单链核酸分子测序文库构建的试剂盒，在一些实施方式中，该试剂盒包括：第一茎环接头和第二茎环接头，其中，所述第一茎环接头具有：第一单链简并序列区，所述第一单链简并序列区位于所述第一茎环接头的5
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端；第一双链区，所述第一双链区与所述第一单链简并序列区远离所述第一茎环接头的5
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末端的一侧相连；和第一单链环区，所述第一单链环区的两个末端分别与所述第一双链区远离所述第一单链简并序列区一侧的两个末端相连，所述第二茎环接头具有：第二单链简并序列区，所述第二单链简并序列区位于所述第二茎环接头的3
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端；第二双链区，所述第二双链区与所述第二单链简并序列区远离所述第二茎环接头的3
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末端的一侧相连；和第二单链环区，所述第二单链环区的两个末端分别与所述第二双链区远离所述第二单链简并序列区一侧的两个末端相连。
[0010]在本专利技术的第五方面，本专利技术提出了一种游离核酸测序方法。在一些实施方式中，该方法包括：获取游离核酸；对所述游离核酸进行变性处理，以便获得单链核酸分子；基于所述单链核酸分子，根据以上所述的方法构建测序文库；对所述测序文库进行测序，以便获得测序数据。
附图说明
[0011]图1显示了根据本专利技术实施例的单链核酸分子测序文库构建方法的流程示意图。
[0012]图2显示了根据本专利技术实施例的茎环接头的结构示意图。
[0013]图3显示了根据本专利技术实施例的建库结果比对分析示意图，其中，实施例1、10
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12中的单链核酸建库1和2为两个平行样；实施例1、10
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12中的常规双链核酸建库1和2为两个平行样；实施例2～9中的1和2均为两个平行样；“*”指代有不同的二聚体含量，“+”代表＜3％、“++”代表＜10％、“+++”代表＜20％。
[0014]图4显示了根据本专利技术实施例的相对荧光单位
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分析时间的分析示意图，其中，“a”指实施例1
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单链核酸建库1；“b”指实施例9
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1；“c”指实施例1
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常规双链核酸建库1。
[0015]图5显示了根据本专利技术实施例的相对荧光单位
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分析时间的分析示意图，其中，“d”指实施例10
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单链核酸建库1；“e”指实施例10
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常规双链核酸建库1。
[0016]图6显示了根据本专利技术实施例的测序结果比对分析示意图，其中，实施例1、10
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12中的单链核酸建库1和2为两个平行样；实施例1、10
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12中的常规双链核酸建库1和2为两个平行样；实施例9中的1和2均为两个平行样。
具体实施方式
[0017]下面详细描述本专利技术的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发
明，而不能理解为对本专利技术的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0018]在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种单链核酸分子测序文库构建方法，在一些实施方式中，参考图1，该方法包括以下步骤：
[0019](1)使单链核酸分子的两端分别与第一茎环接头和第本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单链核酸分子测序文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)使单链核酸分子的两端分别与第一茎环接头和第二茎环接头进行连接，以便获得连接产物；和(2)对步骤(1)所述连接产物进行扩增处理，以便获得扩增产物，所述扩增产物携带测序引物区，所述扩增产物构成所述测序文库，其中，所述第一茎环接头具有：第一单链简并序列区，所述第一单链简并序列区位于所述第一茎环接头的5
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端；第一双链区，所述第一双链区与所述第一单链简并序列区远离所述第一茎环接头的5
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末端的一侧相连；和第一单链环区，所述第一单链环区的两个末端分别与所述第一双链区远离所述第一单链简并序列区一侧的两个末端相连，所述第二茎环接头具有：第二单链简并序列区，所述第二单链简并序列区位于所述第二茎环接头的3
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端；第二双链区，所述第二双链区与所述第二单链简并序列区远离所述第二茎环接头的3
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末端的一侧相连；和第二单链环区，所述第二单链环区的两个末端分别与所述第二双链区远离所述第二单链简并序列区一侧的两个末端相连。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述第一双链区与所述第二双链区的序列不同。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述第一双链区与所述第二双链区的长度相同。4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述第一双链区与所述第二双链区不完全互补。5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述第一双链区与所述第二双链区的序列之间至少存在2个不匹配的碱基位点。6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述第一双链区的3
’
末端与所述第二双链区序列不存在连续3个以上匹配的碱基序列。7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述第一双链区的3
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末端与所述第二茎环接头序列不存在连续3个以上匹配的碱基序列。8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述第一单链简并序列区和所述第二单链简并序列区的长度分别独立地为3～10bp；可选地，分别独立地为5～8bp。9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述第一双链区和所述第二双链区的长度分别独立地为13～20bp；可选地，分别独立地为15～18bp。10...

【专利技术属性】
技术研发人员：关媛妹，李洪洲，
申请(专利权)人：广东菲鹏生物有限公司，
类型：发明
国别省市：