一种基于全自动数字PCR一体机的单细胞检测方法技术

本发明专利技术涉及单细胞检测分析领域，公开了一种用于单细胞检测和分析的方法。该方法通过利用全自动数字PCR一体机实现对样品进行单细胞分离、细胞裂解和检测分析，实现了数字PCR一体机应用范围的扩大，使其能够用于微量细胞的检测，同时能够精准检测样品中每个单细胞内的目标基因。本发明专利技术的方法具有可视化操作，检测结果准确快速，同时进行定性和定量检测的优点。同时进行定性和定量检测的优点。同时进行定性和定量检测的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种基于全自动数字PCR一体机的单细胞检测方法


[0001]本专利技术涉及一种单细胞检测的方法，具体涉及一种使用数字PCR仪器对单细胞进行检测的方法，特别涉及一种使用全自动数字PCR一体机进行单细胞检测的方法。

技术介绍

[0002]随着现代生物学的发展和社会需求的不断提高，仅分析细胞群体的核酸序列已经不能满足需要，有必要对单细胞进行检测和测序。
[0003]为满足以上需求，发展出了qPCR技术，其基本原理是，通过荧光活化细胞分选、免疫磁性富集、显微抽取、流式细胞术、激光捕获显微切割或各种自动化的设备，例如哈佛大学的液滴测序技术(Drop
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seq)来收集单个细胞，进行裂解并收集和提纯核酸物质，扩增和测序。
[0004]然而，以上的操作仍然是非常繁琐的，分离出的细胞需要转移到对应的微反应体系中进行裂解和核酸物质的提取与纯化，之后再转移到对应的微反应体系，或者加入扩增原料进行扩增。在需要对大量细胞进行以上操作时，即使完全自动化完成，效率也是较为低下的。在不同的步骤中使用的酶和原料也可能相互干扰，导致难以进行一站式操作。
[0005]数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术，其采用微流控或微液滴化方法，将稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微液滴中，每个反应器的核酸模板数少于一个或等于一个，经过PCR循环后，有核酸分子模板的反应器会给出荧光信号，没有模板的反应器没有荧光信号，从而可以推测出原始溶液的核酸浓度。

技术实现思路

[0006]为解决上述问题，本专利技术提供一种单细胞检测的方法，其特征在于：步骤一：制备单细胞分离体系；所述单细胞分离体系包括经荧光染色的待测细胞、扩增原料、引物、探针和Taq酶；步骤二：使用全自动数字PCR一体机，将所述单细胞分离体系分散成至多包含一个细胞的微液滴，并使微液滴平铺在数字PCR检测板上；步骤三：在明场和荧光场观察，对包裹有细胞的微液滴计数；步骤四：热裂解细胞，在荧光下观察微液滴，对仍能够观察到存在细胞形态的微液滴进行即时计数，并计算细胞裂解率，直至细胞裂解率达到预设值，细胞裂解率=(步骤三中包括有细胞的微液滴数
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仍具细胞形态的微液滴数)/步骤三中包括有细胞的微液滴数；步骤五：升温至95℃继续加热10
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20分钟，优选15分钟，以启动Taq酶，并降温退火，完成第一次扩增；循环进行预定次数的扩增，统计高亮微液滴数。
[0007]所述全自动数字PCR一体机，指将在一台设备上实现全自动微液滴生成、PCR扩增、荧光信号收集的数字PCR仪器。示例性的型号如：Sniper公司的DQ
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24，赛默飞公司的Applied Biosystems
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QuantStudio
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Absolute Q
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等，不同厂商的型号在处理能力上有所区别，但均不影响实施本专利技术的技术方案。
[0008]作为优选，步骤二中，使用全自动数字PCR一体机的控制程序，设定所述微液滴体积为0.3至1.5nL之间的数值，更优选地，设定0.6至1.0 nL的数值。
[0009]作为优选，步骤二中观察发现微液滴有重叠时，加热到60℃，使微液滴平铺。实验中发现，通过加热可以在5分钟内使微液滴有效平铺，因此加热时间可以统一设定为5分钟，也可以在观察到重叠消失后停止加热。
[0010]在步骤三、步骤四和步骤五中，可以人工计数，也可以自动计数和计算。
[0011]作为优选，热裂解细胞的温度为85℃。如果裂解操作过程中发现仍然含有完整细胞形态的微液滴较多，则证明裂解尚未完成，应当延长裂解时间，和/或提高温度。直至裂解率达到预设标准。作为示例，可以设定裂解率不低于80%、90%、95%或其他数值作为预设标准，也可以根据检测精度需要设定其他数值。测定裂解率的另一个好处是，即使裂解效果不佳，也可以根据该数值对最终测定结果进行数值修正和误差预估，例如裂解率为80%，则可以在计算突变细胞总数时，将最终结果中的高亮液泡数
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0.8，如需要计算突变率，也可以使用例如本专利技术实施例6中的计算方式来修正。本领域技术人员也可以根据需要，根据检测得到的数据，进行各种后期的数据修正和估算。裂解完成后如果视野有荧光信号，证明裂解成功且有感兴趣的细胞，启动裂解、扩增和检测过程。即使未发现整体有高亮荧光信号的微液滴，可能是荧光信号不够强，需要扩增若干轮再统计其中高亮的微液滴数。最终统计的高亮微液滴数即为该检测板上具有与引物所对应的特定基因的细胞的数量。
[0012]当待测细胞含有两种或两种以上类型的细胞时，作为一种方案，对其中至少一种细胞单独染色，使其可以在荧光下与其他类型的细胞区分和单独计数。所述单独染色是指，仅对待测细胞中的一种细胞进行荧光染色，或者使某种待测细胞与其他待测细胞的荧光染色颜色不同。本专利技术中，为展示技术效果，采用提前单独染色的细胞进行实验，本领域技术人员容易想到的是，面对混合的多种细胞时，可以通过例如特异性抗体偶联荧光染色剂的方式对其中感兴趣的某种细胞进行单独染色。此种技术手段是常规的，因此不再单独给出示例。作为另一种方案，还可以设置所述单细胞分离体系含有的引物和对应的探针能够检测特定位点，所述特定位点是待测细胞中的一种所特有的。采用该方法能够识别出不同类型的细胞，也可以识别出同类型细胞里发生了特定的基因突变的少量细胞，从而进一步提高检测精度和拓展本技术的应用范围。作为优选，当步骤三中未发现单独荧光染色的细胞时（整个视野无荧光点），停止该数字PCR检测板的检测，不进行后续的裂解和扩增。如此可以节省检测的时间和机器的占用。
[0013]当待测细胞中可能含有多种类型的表达或突变时，还可以在所述单细胞分离体系中设置检测不同位点的多种引物和探针，对应不同位点的多种探针的发光颜色不同。目前市售的全自动数字PCR一体机一般具有多个荧光检测通道，可以检测不同波长的荧光。通过该优选的方法，可以区分不同类型的表达或突变。
[0014]本专利技术还进一步提供所述单细胞分离体系，包括经荧光染色的待测细胞、扩增原料、引物、探针和Taq酶。荧光染色是生物实验室的常规操作，其余原料均有市售产品，可以分别购买，也可以购买包含多种成分的预混液用于稀释和混合配制。本领域技术人员知晓检测不同细胞时如何选择引物和探针。
[0015]本专利技术技术方案与现有技术相比，至少具有以下一项有益效果：第一，通过即时监测，保证包裹和裂解的成功率，防止出现漏检。并且可以使用中
间数据修正最终数据和估计误差范围。
[0016]第二，在存在多种细胞时，能够及时识别出感兴趣的细胞，进行裂解和扩增，从而缩短检测时间，减少后续数据处理的压力。
[0017]第三，能够同时完成定量和定性检测，既能检测出突变的类型，又能检测出该类型突变细胞的个数。
附图说明
[0018]通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1为实施例1中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单细胞检测的方法，其特征在于：步骤一：制备单细胞分离体系；所述单细胞分离体系包括经荧光染色的待测细胞、扩增原料、引物、探针和Taq酶；步骤二：使用全自动数字PCR一体机，将所述单细胞分离体系分散成至多包含一个细胞的微液滴，并使微液滴平铺在数字PCR检测板上；步骤三：在明场和荧光场观察，对包裹有细胞的微液滴计数；步骤四：热裂解细胞，在荧光场下观察微液滴，对仍能够观察到存在细胞形态的微液滴进行即时计数，并计算细胞裂解率，直至细胞裂解率达到预设值，细胞裂解率=(步骤三中包括有细胞的微液滴数
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仍具细胞形态的微液滴数)/步骤三中包括有细胞的微液滴数；步骤五：升温至95℃保持10
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20分钟以启动Taq酶，并降温退火，完成第一次扩增，循环进行预定次数的扩增，统计高亮微液滴数。2.如权利要求1所述的一种单细胞检测的方法，其特征在于：步骤二中，使用所述全自动数字PCR一体机的控制程序，设定所述微液滴体积为0.3至1.5nL之间的数值。3.如权利要求1所述的一种单细胞检测的方法，其特征在于：步骤二中观察发现微液滴有重叠时，加热到60℃使其平铺。4.如权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：李奎，全智慧，裘宇容，于雪，滕祥云，
申请(专利权)人：广州华银康医疗集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：