一种PCR扩增后的产物快速检测方法技术

本发明专利技术属于检测领域，具体的涉及一种PCR扩增后的产物快速检测方法。本发明专利技术能够优化待测产物基因检测的步骤，节省普通PCR检测后需要琼脂糖凝胶电泳的时间，提高效率；操作过程无需打开PCR管，避免了操作过程中的气溶胶对不同样本孔的潜在污染，提供了一种更简便、高效和无污染的普通PCR后的产物快速可视化检查方法，且对后期进行琼脂糖凝胶电泳无影响。本发明专利技术技术方案准确方便，快速有效，适用于普通PCR后的待测基因结果判断。PCR后的待测基因结果判断。PCR后的待测基因结果判断。

【技术实现步骤摘要】
一种PCR扩增后的产物快速检测方法


[0001]本专利技术属于检测领域，具体的涉及一种PCR扩增后的产物快速检测方法。

技术介绍

[0002]聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。检测某种微生物中是否存在特定DNA，需要通过PCR反应进行DNA扩增，再通过往PCR产物中加入核酸染料、琼脂糖凝胶电泳(约30min)，最后通过凝胶成像仪显示特异性条带来判断该微生物中是否存在某种特定DNA。
[0003]目前所用的PCR产物检测方法虽然也能够判断微生物中是否存在某种特定DNA，但是现有的PCR产物检测方法步骤繁琐，耗时长，必须通过琼脂糖凝胶电泳显示条带才可观察。
[0004]所以目前缺少一种能够在PCR扩增后能够快速读取结果的方法，以解决当前各种检测任务越来越重的问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术为了解决上述
技术介绍
中目前缺少一种能够在PCR扩增后能够快速读取结果的方法的技术问题，提供一种PCR扩增后的产物快速可视化的检测方法。
[0006]本专利技术采用的技术方案如下：
[0007]本专利技术一方面提供了一种PCR扩增后的产物快速可视化的检测方法，包括如下步骤：
[0008]S1、向碱性橙14中加入无菌水，得到碱性橙14稀释液；
[0009]S2、取待测产物，配置PCR体系后加入步骤S1中的碱性橙14稀释液，接着用无菌水补足反应体系，接着启动PCR扩增反应，得到扩增产物；
[0010]S3、取与步骤S2中等量的无菌水，配置与步骤S2中相同的PCR体系后加入步骤S1中的碱性橙14稀释液，接着用无菌水补足反应体系，接着启动PCR扩增反应，得到空白对照产物；
[0011]S4、将步骤S2得到的扩增产物和步骤S3中得到的对照产物采用紫外光照射或紫外凝胶成像仪成像仪观察结果，判断所述待测产物是否为阳性。
[0012]在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以做如下改进。
[0013]进一步，在步骤S1中，所述碱性橙14与所述无菌水的体积比为1:160。
[0014]进一步，在步骤S2中，PCR体系为混液12.5μL，模板2.0μL，上、下游引物各0.5μL，无菌双蒸水补足体系至25μL。反应条件为94℃预变性5min，94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸50s，35个循环，最后于72℃延伸10min，4℃保存。
[0015]进一步，在步骤S2中，加入碱性橙的量为1.0ul。
[0016]进一步，在步骤S4中，所述判断的具体过程是，将检测结果通过ImageJ软件进行图
片灰度化以获得对应灰度值；
[0017]当待测产物灰度值/空白对照灰度值大于或等于1.42时，待测产物为阳性；
[0018]当待测产物灰度值/空白对照灰度值小于1.42时，待测产物为阴性。
[0019]进一步，所述待测产物阳性的最低检测限为3.94ng/μl。
[0020]本专利技术另一方面提供了一种碱性橙14在PCR扩增后的产物快速可视化的检测方法中的应用，所述碱性橙14为3,6
‑
双(二甲基氨基)吖啶氯化锌盐酸盐，分子式为C
34
H
40
Cl4N6Zn。
[0021]本专利技术的有益效果是，本专利技术能够优化待测产物基因检测的步骤，节省普通PCR检测后需要琼脂糖凝胶电泳的时间，提高效率；操作过程无需打开PCR管，避免了操作过程中的气溶胶对不同样本孔的潜在污染，提供了一种更简便、高效和无污染的普通PCR后的产物快速可视化检查方法，且对后期进行琼脂糖凝胶电泳无影响。本专利技术技术方案准确方便，快速有效，适用于普通PCR后的待测基因结果判断。
附图说明
[0022]图1为本专利技术实施例1中紫外光照射观察结果图；
[0023]图2为本专利技术实施例2中紫外光照射观察结果图；
[0024]图3为本专利技术实施例1中紫外光照射观察结果图与电泳法检测结果对照图；
[0025]图4为本专利技术实施例2中紫外光照射观察结果图与电泳法检测结果对照图。
具体实施方式
[0026]以下结合附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。
[0027]实施例1、
[0028]一种PCR扩增后的产物快速可视化的检测方法，包括如下步骤：
[0029]S1、向碱性橙14中加入无菌水，按照碱性橙14与无菌水的体积比1:160进行配置，得到碱性橙14稀释液；
[0030]S2、取含有鲍曼不动杆菌的待测产物，配置PCR体系后加入步骤S1中的碱性橙14稀释液，接着用无菌水补足反应体系，接着启动PCR扩增反应，得到扩增产物；
[0031]PCR反应体系为：预混液12.5μL，模板2.0μL，上、下游引物各0.5μL，无菌双蒸水补足体系至25μL。反应条件为94℃预变性5min，94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸50s，35个循环，最后于72℃延伸10min，4℃保存。
[0032]S3、取与步骤S2中等量的无菌水，配置与步骤S2中相同的PCR体系后加入1.0ul步骤S1中的碱性橙14稀释液，接着用无菌水补足反应体系，接着启动PCR扩增反应，得到空白对照产物；
[0033]S4、取与步骤S2中等量的不含有鲍曼不动杆菌的待测产物，配置与步骤S2中相同的PCR体系后加入步骤S1中的碱性橙14稀释液，接着用无菌水补足反应体系，接着启动PCR扩增反应，得到阴性对照产物；
[0034]S5、将步骤S2得到的扩增产物、步骤S3中得到的空白对照产物和步骤S4得到的阴性对照产物采用紫外光照射观察结果并用将检测结果通过ImageJ软件进行图片灰度化以
获得对应灰度值，得到如图1所示：
[0035]编号1和编号2为步骤S2中所述扩增产物，编号3和编号4为步骤S4中所述阴性对照产物，编号5和编号6为步骤S3中所述空白对照产物。
[0036]编号1的待测产物灰度值/空白对照灰度值为1.5358，编号2的待测产物灰度值/空白对照灰度值为1.5975，故含有鲍曼不动杆菌的待测产物显示为阳性，即成功检测出含有鲍曼不动杆菌。
[0037]编号3的待测产物灰度值/空白对照灰度值为0.6576，编号4的待测产物灰度值/空白对照灰度值为0.6268，故不含有鲍曼不动杆菌的待测产物显示为阴性，即未检测出含有鲍曼不动杆菌。
[0038]编号5的待测产物灰度值/空白对照灰度值为0.5860，编号6的待测产物灰度值/空白对照灰度值为0.4766，待测产物灰度值/空白对照灰度值为0.6576，故无菌水显示为阴性，即未检测出含有鲍曼不动杆菌。
[0039]实施例2、
[0040]与实施例1的区别在于，在步骤S2中，将含有鲍曼不动杆菌的待测产物分别稀释0倍，10倍，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种PCR扩增后的产物快速可视化的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、向碱性橙14中加入无菌水，得到碱性橙14稀释液；S2、取待测产物，配置PCR体系后加入步骤S1中的碱性橙14稀释液，接着用无菌水补足反应体系，接着启动PCR扩增反应，得到扩增产物；S3、取与步骤S2中等量的无菌水，配置与步骤S2中相同的PCR体系后加入步骤S1中的碱性橙14稀释液，接着用无菌水补足反应体系，接着启动PCR扩增反应，得到空白对照产物；S4、将步骤S2得到的扩增产物和步骤S3中得到的对照产物采用紫外光照射或紫外凝胶成像仪成像仪观察结果，判断所述待测产物是否为阳性。2.根据权利要求1所述的PCR扩增后的产物快速可视化的检测方法，其特征在于，在步骤S1中，所述碱性橙14与所述无菌水的体积比为1:160。3.根据权利要求1所述的PCR扩增后的产物快速可视化的检测方法，其特征在于，在步骤S2中，PCR体系为混液12.5μL，模板2.0μL，上、下游引物各0.5μL，无菌双蒸水补足体系至25μL。反应条件为94℃预变性5min，94℃变...

【专利技术属性】
技术研发人员：余琳，林勇平，张瀞之，吴梓曼，
申请(专利权)人：广州医科大学附属第一医院广州呼吸中心，
类型：发明
国别省市：