PCR反应体系、反应试剂、试剂盒和方法技术

本发明专利技术涉及一种PCR反应体系、反应试剂、试剂盒和方法。该PCR反应体系不含甘油和DMSO，包含：0.7M～1M甜菜碱、10ng/μL～300ng/μL DNA聚合酶、10μM～200μM dNTP、20mM～50mM Tris

【技术实现步骤摘要】
PCR反应体系、反应试剂、试剂盒和方法


[0001]本专利技术涉及PCR扩增
，特别是涉及一种PCR反应体系、反应试剂、试剂盒和方法。

技术介绍

[0002]水稻是人类重要的粮食作物之一，总产量占世界粮食作物产量第三位，种植与食用的历史都相当悠久。随着社会经济的发展和生活水平的提高，人们对稻米品质和产量的要求也相应的不断提高。为提高水稻产量和品质，从分子水平研究水稻叶片是一个重要的方向。
[0003]水稻叶片分子水平上的研究过程中，提取水稻叶片的DNA和扩增出相应的基因片段是必不可少的环节。目前的方法主要有两种：一种通过CTAB法提取水稻叶片的DNA并纯化之后进行相应的PCR扩增反应而收获目的基因片段(即传统法)，另一种是通过裂解液裂解水稻叶片后取裂解上清或直接使用水稻叶片进行相应的PCR扩增反应而收获目的基因片段(即直扩法)。传统法的过程较为繁琐，但成功率高，而直扩法操作简单，但成功率较低。

技术实现思路

[0004]基于此，有必要提供一种能够改善直接采用水稻叶片进行扩增的直扩法的成功率的PCR反应体系。
[0005]此外，还有必要提供一种能够改善直接采用水稻叶片进行扩增的直扩法的成功率的PCR反应试剂和试剂盒、以及一种成功率高的PCR方法。
[0006]一种PCR反应体系，所述PCR反应体系不含甘油和DMSO，所述PCR反应体系包含：0.7M～1M甜菜碱、10ng/μL～300ng/μLDNA聚合酶、10μM～200μM dNTP、20mM～50mM Tris
>‑
HCl、1mM～4mM Mg
2+
、70mM～80mM K
+
、10mM～30mM NH
4+
、0.1％(v/v)～0.25％(v/v)表面活性剂及0.01％(m/v)～0.1％(m/v)BSA。
[0007]上述PCR反应体系不含甘油和DMSO，含有甜菜碱、DNA聚合酶、dNTP、Tris
‑
HCl、Mg2
+
、K
+
、NH
4+
、表面活性剂及BSA，通过各组分的相互配合，上述PCR反应体系应用于水稻叶片的直扩时，具有较高的成功率。
[0008]在其中一个实施例中，所述DNA聚合酶包括DeepVentDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶和TaqDNA聚合酶；在所述PCR反应体系中，所述DeepVentDNA聚合酶的浓度为0.5ng/μL～2ng/μL，所述PfuDNA聚合酶的浓度为100ng/μL～300ng/μL，所述TaqDNA聚合酶的浓度为10ng/μL～100ng/μL；
[0009]优选地，所述PCR反应体系还包含0.1ng/μL～0.5ng/μL复制因子A和/或100ng/μL～200ng/μL焦磷酸酶。
[0010]在其中一个实施例中，所述PCR反应体系包含0.5mM～2mMNaOH。
[0011]在其中一个实施例中，所述表面活性剂包括曲拉通X
‑
100、吐温
‑
20及NP
‑
40中的至少一种；
[0012]和/或，所述PCR反应体系还包含染料；所述染料包括二甲苯青和柠檬黄中的至少一种。
[0013]一种PCR反应试剂，以40mL总体积的2倍体系计，所述PCR反应试剂包含：
[0014]5×
buffer16mL；
[0015]5M甜菜碱16mL；
[0016]DNA聚合酶2.72mL；及
[0017]dNTP640μL；
[0018]其中：
[0019]5×
buffer包含：100mM～250mMTris
‑
HCl、5mM～20mMMg
2+
、250mM～400mMK
+
、50mM～125mMNH
4+
、0.5％(v/v)～25％(v/v)表面活性剂、0.05％(m/v)～0.5％(m/v)BSA；
[0020]在所述40mL总体积的2倍体系中，DNA聚合酶的终浓度为200ng/μL～600ng/μL，dNTP的终浓度为20μM～400μM。
[0021]在其中一个实施例中，在所述40mL总体积的2倍体系中，所述DNA聚合酶包括2.4mL浓度为16ng/μL～80ng/μL的DeepVentDNA聚合酶、160μL浓度为50ng/mL～150ng/mL的PfuDNA聚合酶和160μL浓度为5ng/mL～50ng/mL的TaqDNA聚合酶；
[0022]优选地，所述PCR反应试剂还包含2mL浓度为5ng/μL～35ng/μL复制因子A和/或100μL浓度为80ng/mL～160ng/mL焦磷酸酶；
[0023]进一步地，所述PCR反应试剂包含1mM～4mMNaOH。
[0024]在其中一个实施例中，所述表面活性剂包括曲拉通X
‑
100、吐温
‑
20及NP
‑
40中的至少一种；
[0025]和/或，所述PCR反应试剂还包含染料，所述染料包括二甲苯青和柠檬黄中的至少一种。
[0026]一种PCR试剂盒，所述试剂盒包括上述的PCR反应体系或上述的PCR反应试剂。
[0027]一种PCR方法，采用上述的PCR反应体系或上述的PCR反应试剂对植物叶片进行PCR反应；
[0028]优选地，将所述植物叶片直接置于所述PCR反应体系中进行PCR反应。
[0029]在其中一个实施例中，所述PCR反应的总体积为20μL～50μL。
附图说明
[0030]图1～图3为实施例1的原T5优化过程中裂解成分及浓度的确定时的结果；
[0031]图4为实施例1的离子浓度优化过程中研究甘油和DMSO的影响的结果；
[0032]图5～图7为实施例1离子浓度优化过程中不同浓度的K
+
和NH
4+
的结果；
[0033]图8为实施例1的甜菜碱优化过程中的甜菜碱不同浓度的结果；
[0034]图9为实施例1的在已添加NaOH和BSA的基础上的酶浓度优化过程中DVS和Mja不同浓度的结果；
[0035]图10～图14为实施例1中在重新优化的K
+
、NH
4+
、去除DMSO和甘油的基础上优化NaOH和BSA浓度、DVS和Mja酶量的结果；
[0036]图15～图16为实施例1中对最终有无NaOH对扩增效果影响的结果；
[0037]图17～图18为实施例2中T5试剂盒的直接法的扩增效果；
[0038]图19为实施例2中T5试剂盒的不同叶片类型的扩增效果；
[0039]图20为实施例2中T5试剂盒对长片段的扩增效果；
[0040]图21为实施例2中对T5试剂盒的稳定性测试；
[0041]图22为实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种PCR反应体系，其特征在于，所述PCR反应体系不含甘油和DMSO，所述PCR反应体系包含：2.根据权利要求1所述的PCR反应体系，其特征在于，所述DNA聚合酶包括Deep Vent DNA 聚合酶、Pfu DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶；在所述PCR反应体系中，所述Deep Vent DNA聚合酶的浓度为0.5ng/μL～2ng/μL，所述Pfu DNA聚合酶的浓度为100ng/μL～300ng/μL，所述Taq DNA 聚合酶的浓度为10ng/μL～100ng/μL；优选地，所述PCR反应体系还包含0.1ng/μL～0.5ng/μL复制因子A和/或100ng/μL～200ng/μL焦磷酸酶。3.根据权利要求1～2任一项所述的PCR反应体系，其特征在于，所述PCR反应体系包含0.5mM～2mM NaOH。4.根据权利要求3所述的PCR反应体系，其特征在于，所述表面活性剂包括曲拉通X
‑
100、吐温
‑
20及NP
‑
40中的至少一种；和/或，所述PCR反应体系还包含染料；所述染料包括二甲苯青和柠檬黄中的至少一种。5.一种PCR反应试剂，其特征在于，以40mL总体积的2倍体系计，所述PCR反应试剂包含：5.一种PCR反应试剂，其特征在于，以40mL总体积的2倍体系计，所述PCR反应试剂包含：其中：5
×
buffer包含：100mM～250mM Tris
‑
HCl、5mM～20mM Mg
2+
、250mM～400mM K
+
、50mM～125mMNH
4+
、0.5％(...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖晓文，李妍，王珊珊，
申请(专利权)人：北京擎科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：