一种实时荧光PCR检测固体检测试剂及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种实时荧光PCR固体检测试剂及其制备方法，所述实时荧光PCR固体检测试剂由保护体系、无甘油缓冲溶液与dNTPs预混液、特异性引物探针、无甘油Taq聚合酶混合后经冷冻干燥处理制备而成。本发明专利技术的实时荧光PCR固体检测试剂，在常温下可保持其原有的诊断效果与灵敏度至少2年，最低可以检测2个拷贝数的核酸分子。解决了现有实时PCR检测试剂必须现用现配并且在长途运输中需要严格的冷链技术，大幅增加运输和储存支出，并因此导致运输时间长，一些不发达地区相关试剂库存不足等问题。一些不发达地区相关试剂库存不足等问题。一些不发达地区相关试剂库存不足等问题。

【技术实现步骤摘要】
一种实时荧光PCR检测固体检测试剂及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体为一种固体实时荧光PCR固体检测试剂及其制备方法。

技术介绍

[0002]聚合酶链式反应(PCR)提供了一种通用的方法来复制特定DNA序列，以供进一步研究。实时荧光PCR是在PCR技术的基础上开发出来的，实时荧光PCR技术可以通过检测反应系统中荧光染料引起的荧光信号来监控PCR期间目标DNA序列或分子的扩增，并且可以实现极高的灵敏度，从而实现检测限(LOD)少于5个拷贝的目标DNA(在某些情况下只有1个拷贝)，该技术手段迅速发展并开始广泛应用于生物学研究，临床诊断，刑事调查，生物医学研究等。实时荧光PCR检测时除了被检测的样品萃取液外，检测试剂主要为聚合酶、引物探针、dNTPs以及缓冲液配制的水溶液，这些组分对存储环境对温度变化及其敏感，需要在生产、运输、以及储存过程中保持恒定的低温(一般为
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20摄氏度左右)，在常温(25摄氏度)条件下以液态保存保存，有效期不超过2天；并且各组分需要在低温下单独存放，现用现配，这大幅度提高了检测试剂的运输和储存成本，并造成了许多国家和地区的检测试剂储量不足，在一些发展中和落后地区更为严重，使得这些地区无法及时发现和应对一些紧急诸如新型冠状病毒流行等的公共健康事件。冻干技术被认为是解决该问题的方式之一，然而目前的冻干试剂产品仍然存在保质期较短，灵敏度较低，并且二者难以稳定控制的问题。
[0003]目前的实时PCR检测试剂大多以液体形式供应给各个检测单位并保存，为了保证检测试剂的功效，在现有大多数产品的存储、和运输过程中，需要保持检测试剂的所有组分在恒定的低温条件下，并在跨地区调配的过程中保证不间断的冷链运输技术，以确保产品在生产端，运输端和使用端都能保持在足够的低温环境下。检测机构将试剂组分，或其几种组分预先处理好的混合液与其他必要组分分别保存在低温环境下，现用现配。有少数报道使用冷冻干燥技术对实时荧光PCR检测试剂进行处理，以提高常温下的保质期，但是仍然存在产品质量以及检测灵敏度难以控制，保质期相对较短，产品必须在严格控制的干燥环境下保存等问题。同时由于现有的试剂在需要持续不间断的低温保存环境，并在跨地区调配过程中保持不间断的恒温冷链运输，持续的低温储存环境以及严苛的冷链运输要求，在一些欠发达地区很难实现。在常温下，大多数含有聚合酶的实时荧光PCR检测试剂只能维持原有功效24小时左右。同时，温度的波动，以及未达到足够低温的保存环境都会影响检测试剂中聚合酶甚至其他组分的检测效果，造成误诊、漏诊。在少数现有的使用冷冻干燥技术以及一些保护配方对实时荧光PCR固体检测试剂进行处理的产品中，仍然存在着产品质量难以控制，以及检测灵敏度相对不高，保质期相对较短，并且产品仍然需要一直处在严格控制的干燥环境下等问题。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的不足，本专利技术提出一种实时荧光PCR固体检测试剂及其制备方法，
所述固体检测试剂是由保护体系、无甘油缓冲溶液与dNTPs预混液、特异性引物探针、无甘油Taq聚合酶混合后经冷冻干燥处理制备而成；所述保护体系为包含以下质量浓度组分的水溶液：海藻糖0.1～0.5g/mL、Type A明胶5～25mg/mL、糊精0.5～2.5mg/mL、壳聚糖0.1～0.5mg/mL、聚蔗糖0.05～0.25g/mL、纤维素0.5～1.0mg/mL，溶剂为超纯水。
[0005]进一步，所述无甘油缓冲溶液与dNTPs预混液由以下摩尔浓度的组分组成：0.2mol/L KCl、0.2mol/L Tris
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HCl、0.2mol/L(NH4)2SO4、0.05mol/L MgCl2、0.5mmol/L dNTPs，溶剂为超纯水。
[0006]进一步，所述纤维素为羟乙基纤维素和甲基纤维素其中之一或二者混合物。
[0007]所述实时荧光PCR固体检测试剂的制备方法，包括如下步骤：
[0008]1)将上述保护体系预混合；
[0009]2)将上述无甘油缓冲溶液与dNTPs预混液5～15μL、1μmol/L的特异性引物探针2～6μL与上述保护体系10～30μL震荡混合均匀；
[0010]3)加入1～3个单位的无甘油Taq聚合酶，震荡混合均匀；
[0011]4)将步骤3)配制好的材料置于
‑
25～
‑
30℃的低温中冷冻2～6h；
[0012]5)即时将步骤4)获得的材料转移至真空干燥机中，室温下真空干燥处理1
‑
3小时；
[0013]6)干燥结束后即获得所述实时荧光PCR固体检测试剂，将所获得的实时荧光PCR固体检测试剂置于PP试剂管中密封常温保存。
[0014]进一步，所述步骤5)的室温为16
‑
35℃。
[0015]进一步，所述步骤5)的真空干燥处理时间为2小时。
[0016]与现有技术相比，本专利技术提供一种实时荧光PCR固体检测试剂及其制备方法，具备以下有益效果：
[0017]1、按照本专利技术所述的配方与制作流程，将所有进行实时荧光PCR检测所必须的组分进行混合和前处理，冷冻干燥处理后得到干燥的多孔实时荧光PCR固体检测试剂，在常温下可保持其原有的检测效果与灵敏度至少2年，最低可以检测2个拷贝数的核酸分子。本专利技术的保护体系主要由海藻糖、明胶、糊精、壳聚糖、聚蔗糖、羟乙基纤维素以及甲基纤维素组成。海藻糖是一种广泛应用的生物冷冻保护剂，与试剂中的聚合酶以及其他有效成分之间形成氢键以替代这些成分周围的水分子，或将水分子与聚合酶和其他有效成分隔离开，从而稳定聚合酶的折叠结构，以保护有效成分在干燥处理前的预冻过程中的活性，与蛋白形成氢键结合，保证功能物质在较高温度下能储存更长时间。本发所述的明胶作为产品的重要载体物质，而不是传统的牛血清蛋白作为载体配方。牛血清蛋白运用到实时荧光PCR检测中时，会随着扩增温度的升高而变性，不可逆地形成白色固体物质，影响核酸的扩增以及荧光信号的采集，而明胶的成胶性能随温度变化明显，在低温下可形成稳定的凝胶，并且过程可逆，可以很好地避免这个问题。通过实验，发现使用Type A明胶可以在最大程度上避免其对于荧光信号的干扰。糊精是大分子的淀粉在水解时产生的中间物质，在冷冻过程中可以使得体系更加蓬松，避免由于大的冰晶导致的对功能物质的破坏，同时利于水分子流通，使干燥更快，产物质地更加均匀。壳聚糖作为一种相比其他组分在水中的溶解度略低的多糖，与其他保护物质相互作用，在不影响整体复溶速度的情况下，少量添加以提高干燥产物的耐潮湿能力。聚蔗糖因其多羟基结构，可以与功能物质作用并保护其在高温保存时的稳定性。除此之外，聚蔗糖能够可以进一步调控体系的黏度，融点以及玻璃化转变温度，使得干
燥过程能够在更加易得的环境下进行。羟乙基纤维素和甲基纤维素，可以分别调节体系在不同温度下的黏度，使得干燥速度更快，获得的多孔材料更均匀稳定和耐潮。同时，由于甘油会吸收大量空气中的水分，以至于造成固体检测试剂本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种实时荧光PCR固体检测试剂，其特征在于，所述固体检测试剂是由保护体系、无甘油缓冲溶液与dNTPs预混液、特异性引物探针、无甘油Taq聚合酶混合后经冷冻干燥处理制备而成；所述保护体系为包含以下质量浓度组分的水溶液：海藻糖0.1～0.5g/mL、Type A明胶5～25mg/mL、糊精0.5～2.5mg/mL、壳聚糖0.1～0.5mg/mL、聚蔗糖0.05～0.25g/mL、纤维素0.5～1.0mg/mL，溶剂为超纯水。2.根据权利要求1所述的实时荧光PCR固体检测试剂，其特征在于，所述无甘油缓冲溶液与dNTPs预混液由以下摩尔浓度的组分组成：0.2mol/L KCl、0.2mol/L Tris
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HCl、0.2mol/L(NH4)2SO4、0.05mol/LMgCl2、0.5mmol/L dNTPs，溶剂为超纯水。3.根据权利要求1所述的实时荧光PCR固体检测试剂，其特征在于，所述纤维素为羟乙基纤维素和甲基纤维素其中之一或二者混合物。4.一种根据权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：杨斯宇，温维佳，
申请(专利权)人：杨斯宇，
类型：发明
国别省市：