一种RNA水平的抗辐射药物筛选方法技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，涉及一种RNA水平的抗辐射药物筛选方法，在筛选待检测药物时，提取经辐射后用药的细胞RNA，进行逆转录PCR，通过PCR产物电泳结果是否出现非特异性条带作为判断该药物是否具有抗辐射作用的依据，如果没有出现非特异性条带，则说明该药物具有抗辐射作用；如果出现非特异性条带，则说明该药物没有抗辐射作用。本发明专利技术从RNA水平检测抗辐射药物的作用，更加敏感；能够瞬间锁定处理因素带来的细胞状态的改变，操作难度低，重复性强；且结果判定简单明确，避免主观因素，判定非常客观；可为新的抗辐射药物的研发提供有力支撑。有力支撑。

【技术实现步骤摘要】
一种RNA水平的抗辐射药物筛选方法

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[0001]本专利技术属于生物医药
，涉及一种RNA水平的抗辐射药物筛选方法，通过提取细胞RNA，进行反转录PCR，然后通过电泳就能判断出该药物是否具有抗辐射功能。

技术介绍
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[0002]随着科技的发展，核技术在军事、医疗、民用领域中的应用愈加广泛，带来巨大福利的同时，也伴随着潜在的威胁。机体如果在短时间内接受大剂量的辐射，会引发急性放射病。对于突发性核辐射事故，治疗原则是初期给予抗辐射药物，之后给予造血为中心的综合性对症治疗。然而由于缺乏有效的对抗辐射、减少辐射对机体的损害的急救性药物，目前基本上限于对症治疗和支持治疗。近年来也发现了一些抗放药物，如氨磷汀(WR2721)、5
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雄烯二醇(5
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AED)、染料木黄酮(BIO300)等，均存在有效时窗窄、副作用严重、防护效果有限、需要其它复杂医疗措施支持等缺点，因此仍需要研发安全有效的急救性药物。
[0003]大剂量辐射对机体的早期作用是引发生物大分子的损伤，其中核酸(DNA和RNA)是最为敏感部分。对于辐射导致的细胞损伤以及抗辐射药物作用的观察，最快速和直接的是针对核酸损伤和修复程度的检测。如果药物在辐射初期能够逆有效转核酸的损伤，则可以作为备选的抗辐射药物进行进一步测试。
[0004]目前核酸损伤层面的检测多集中在DNA断裂检测方面。主要包括单细胞凝胶电泳技术(SCGE)和免疫荧光法检测γH2AX焦点技术。
[0005]单细胞凝胶电泳技术(SCGE)：一种在单细胞水平检测DNA损伤程度的方法。在载玻片上用少量琼脂糖凝胶包埋单个分散细胞，细胞经裂解、解旋和电泳后，断裂的DNA在电场力作用下向阳极移动，经荧光染料染色，在荧光显微镜下观察彗星样图像。该方法存在操作复杂，技术较难掌握，成功率低，检测周期长，重复性差等缺点，实验过程中对细胞DNA频繁操作，加大了DNA链断裂的风险，难以真实反映处理因素所对应的DNA损伤情况。
[0006]免疫荧光法检测γH2AX焦点技术：它是根据DNA双链断裂(double strand breaks，DSBs)可以诱生γH2AX(组蛋白H2A家族成员X的第139位丝氨酸磷酸化即为γH2AX)，并且γH2AX的量和DSBs的量存在相关关系这一事实，利用γH2AX的特异性荧光抗体和荧光显微镜，检测γH2AX焦点形成情况进而对DNA损伤情况进行分析判定。该方法结果判定客观性差。因为焦点大小和荧光强度在不同条件下会发生变化；同时在分析结果时，不仅要分析焦点的多少，同时也要充分考虑焦点的大小及强度；而且，如果焦点较多会出现重叠，很难数清焦点数量。结果判断依赖主观因素较多，难以做到绝对客观。
[0007]以上均是对DNA水平的检测。在生物体内，DNA、RNA、多肽作为中心法则的元素，任何一种元素的损伤与修复，都应从其它元素找出相应的变化。RNA种类繁多，功能多样，即可传递遗传信息，也可调控基因表达和细胞功能；而DNA只负责携带遗传信息；相比较而言，RNA对环境的剧烈变化反应更加迅速。本专利技术从RNA水平检测抗辐射药物的作用，效果更加敏感。

技术实现思路
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[0008]本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的缺点，提供一种RNA水平的抗辐射药物筛选方法。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术提供一种RNA水平的抗辐射药物筛选方法，在筛选待检测药物时，提取经辐射后用药的细胞总RNA,进行反转录PCR，通过观察PCR产物电泳结果是否出现非特异性条带作为判断该药物是否具有抗辐射作用的依据，如果没有出现非特异性条带，说明该药物具有逆转核酸损伤的能力，具有抗辐射作用；如果出现非特异性条带，则说明该药物不能有效修复核酸损伤，没有抗辐射作用；具体步骤为：
[0010](1)获取细胞，将其随机分为3组，第一组为无处理组，不对细胞进行任何处理；第二组为辐射组，对细胞进行辐射；第三组为辐射+用药组，对细胞进行辐射后加入待检测药物；
[0011](2)处理后的3组细胞分别提取总RNA，进行反转录PCR；
[0012](3)将PCR产物进行凝胶电泳，无处理组不出现非特异性扩增条带；辐射组会出现>2Kb的非特异性条带；辐射+用药组如果和无处理组一致，没有非特异性条带，说明该药物具有抗辐射能力。
[0013]所述细胞为动物细胞株，或动物体内分离细胞。
[0014]所述辐射是指进行高能X
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ray或240nm
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280nm波长紫外线辐射。
[0015]所述X
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ray辐射的条件和参数：6MV X
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ray，照射距离100cm，剂量率6Gy/min，总剂量3.5Gy；紫外线辐射的条件和参数：波长253.7nm，照射距离50cm，照射强度360μw/cm2，照射时间20s。
[0016]所述第三组完成辐射后1h加入药物，然后药物作用时间为1h
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2h。
[0017]所述反转录PCR，可以设计引物扩增β
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actin或其他管家基因，作为PCR反应体系和反应条件无误的指示；PCR产物长度控制在350bp
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600bp之间。
[0018]所述PCR反应体系包括模板和PCR试剂；PCR循环次数为17
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24个循环。
[0019]所述模板为反转录得到的cDNA，当PCR反应体系25μl时，模板量为0.2μl
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1.5μl。
[0020]所述PCR反应体系可以不包括引物。
[0021]所述PCR循环条件当中，每一个循环包含的延伸时间为30s。
[0022]除了上述条件，所述PCR反应的其它反应条件(包括体系用量和循环条件)根据PCR试剂的不同而调整。
[0023]在本专利技术技术方案的基础上，在反转录PCR时，可以设计引物用来扩增待检测药物可能会影响的基因，观察该基因表达受药物的影响。
[0024]本专利技术与现有技术相比，从RNA水平检测抗辐射药物的作用，更加敏感；能够瞬间锁定处理因素带来的细胞状态的改变，操作难度低，重复性强；且结果判定简单明确，避免主观因素，判定非常客观；该方法具备高度的敏感性、客观性、简便性和可重复性，可为新的抗辐射药物的研发提供有力支撑。
附图说明：
[0025]图1为本专利技术涉及的实施例1小鼠巨噬细胞RAW264.7经过高能X
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ray辐射后各组细胞的RT
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PCR产物电泳结果示意图，其中A表示非特异性条带。
[0026]图2为本专利技术涉及的实施例2经辐射后的小鼠巨噬细胞RAW264.7的反转录PCR产物电泳结果的非特异性条带来源分析示意图；其中A表示非特异性条带；B表示特异性条带。
[0027]图3为本专利技术涉及的实施例3KM小鼠腹腔巨噬细胞经过紫外线辐射后各组细胞RT
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PCR产物电泳结果示意图，其中A本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种RNA水平的抗辐射药物筛选方法，其特征在于，在筛选待检测药物时，提取经辐射后用药的细胞RNA，进行反转录PCR，通过PCR产物电泳结果是否出现非特异性条带作为判断该药物是否具有抗辐射作用的依据，如果没有出现非特异性条带，则说明该药物具有抗辐射作用；如果出现非特异性条带，则说明该药物没有抗辐射作用。2.根据权利要求1所述的RNA水平的抗辐射药物筛选方法，其特征在于，具体步骤为：(1)获取细胞，将其随机分为3组，第一组为无处理组，不对细胞进行任何处理；第二组为辐射组，对细胞进行辐射；第三组为辐射+用药组，对细胞进行辐射后加入待检测药物；(2)处理后的3组细胞分别提取总RNA，进行反转录PCR；(3)将PCR产物进行凝胶电泳，电泳结果显示，无处理组不出现非特异性扩增条带；辐射组会出现>2Kb的非特异性条带；如果辐射+用药组没有出现非特异性条带，则说明该药物具有抗辐射能力。3.根据权利要求2所述的RNA水平的抗辐射药物筛选方法，其特征在于，所述细胞为动物细胞株或动物体内分离细胞。4.根据权利要求2所述的RNA水平的抗辐射药物筛选方法，其特征在于，所述辐射是指进行高能X
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ray或240nm
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280nm波长紫外线辐射。5.根据权利要求4所述的RNA水平的抗辐射药物筛选方法，其特征在于，所述X<...

【专利技术属性】
技术研发人员：张艳丽，夏玉军，赵毅，闫志勇，任书荣，吕锐，
申请(专利权)人：青岛大学，
类型：发明
国别省市：