一种基于MLPA技术对中药材麦冬与山麦冬进行鉴别的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于多重连接探针扩增技术对中药材麦冬与山麦冬进行鉴别的方法，包括以下步骤：1)提取样品基因组DNA；2)以基因组DNA为模板，利用特异性引物扩增麦冬与山麦冬的叶绿体基因片段并纯化扩增产物；3)将MLPA探针与纯化产物进行杂交；4)利用DNA连接酶将杂交产物进行连接；5)利用通用引物对连接产物进行qPCR扩增；6)收集熔解曲线信号，观测Tm值。本发明专利技术能够在很短的时间内同时鉴别中药材麦冬和山麦冬，该方法具有特异性强，灵敏度高等优点，在中药材真伪鉴定领域有很好的应用前景。在中药材真伪鉴定领域有很好的应用前景。在中药材真伪鉴定领域有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种基于MLPA技术对中药材麦冬与山麦冬进行鉴别的方法


本专利技术属于中药材鉴定领域，具体涉及一种基于多重连接探针扩增(multiplexligation
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dependent probe amplification,MLPA)技术对中药材麦冬与山麦冬进行鉴别的方法。

技术介绍

麦冬和山麦冬作为药用植物已有数千年的历史。麦冬的主要来源是百合科沿阶草属植物麦冬Ophiopogon japonicus(L.f)Ker
‑
Gawl.的干燥块根，具有养阴生津，润肺清心的功效。用于肺燥干咳，阴虚痨嗽，喉痹咽痛，津伤口渴，内热消渴，心烦失眠，肠燥便秘。麦冬是既可以用于预防和治疗，又可用于保健食品范畴的中药，是可药食两用及保健食品的原材料之一。目前，市场上存在多种麦冬的混伪品，这些混伪品主要来源于沿阶草属和山麦冬属 Liriope植物，其中最常见的为山麦冬和阔叶山麦冬。山麦冬来源为百合科山麦冬属植物湖北麦冬Liriope spicata(Thunb.)Lour.var.prolifera Y.T.Ma或短葶山麦冬Liriope muscari(Decne.)Baily的干燥块根。两者均被收录于《中国药典》(2020年版)，药典并未将二者合并，两者性味相同，性状相似，功能与主治相同，易被混用。在市场上，多数商品并未将麦冬和山麦冬进行严格区分，而是将山麦冬作为麦冬的代用品，并一律称为麦冬，且对品种不加注明。由于山麦冬和麦冬的功效并非完全一致且价格不同，二者混用不但会影响药效还会造成经济损失。序列比对筛查发现，在叶绿体基因片段序列中，山麦冬属与沿阶草属间存在3个稳定的变异位点，即A/G、A/T、C/T。由此可得，这3个差异位点可作为两属间的鉴别位点。同时表明，该基因片段序列可作为山麦冬属与沿阶草属的属间鉴别标记。基于此，本专利技术利用MLPA技术结合熔解曲线，针对变异位点设计了特异性探针进行扩增，并由熔解曲线形成的熔解曲线峰得到熔解温度，根据Tm值的差异来鉴别麦冬与山麦冬，并进行特异性、灵敏度、掺伪比实验。本专利技术构建了麦冬类药材基原物种系统鉴定体系，用分子生物学技术针对麦冬和山麦冬药材相互掺杂问题建立快速检测鉴别方法，为麦冬类药材正本清源和临床用药安全提供技术支撑。

技术实现思路

本专利技术采用MLPA方法，针对中药材麦冬和山麦冬的叶绿体基因片段序列设计探针，从而建立一种可同时鉴别麦冬、山麦冬药材的方法。一种基于多重连接探针扩增技术对中药材麦冬与山麦冬进行鉴别的方法，它包括以下步骤：1)提取样品基因组DNA；2)以提取的基因组DNA为模板，利用特异性引物扩增麦冬与山麦冬的叶绿体基因片段并纯化扩增产物；
3)将MLPA探针与纯化产物进行杂交；4)利用DNA连接酶将步骤3)的杂交产物进行连接；5)利用通用引物对步骤4)的连接产物进行qPCR扩增；6)收集熔解曲线信号，观测Tm值。其中，所述MLPA探针共3条，由两条左探针和一条右探针组成，探针序列如下：麦冬左探针：GGGTTCCCTAAGGGTTGGACAAGTATTTAGTCTTTGTAATTTCCAT AGATACAAATAT(SEQ ID NO:1)；山麦冬左探针：GGGTTCCCTAAGGGTTGGACCGCACGATTTAGTCTTTGTAATTT CCATAGATACAAATAC(SEQ ID NO:2)；共同右探针：TCGGCTAGTATGATGCGCGGGAAATGTCTAGATTGGATCTTGCTG GCAC(SEQ ID NO:3)。其中，由麦冬左探针和共同右探针组成的探针组，可单独用于鉴定麦冬；由山麦冬左探针和共同右探针组成的探针组，可单独用于鉴定山麦冬；由麦冬左探针、山麦冬左探针和共同右探针组成的混合体系，可用于麦冬、山麦冬的单独鉴定以及混合样品的鉴定；在进行未知样品的鉴定时，所述MLPA探针组是同时使用而非拆分。其中，所述麦冬与山麦冬的叶绿体基因片段的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:8、9所示。用于扩增所述叶绿体基因片段的特异性上、下游引物序列分别如SEQ ID NO:4、5所示。其中，所述通用引物序列如SEQ ID NO:6、7所示。所述DNA连接酶为9
°
N DNA Ligase。优选地，所述MLPA探针中，麦冬左探针、山麦冬左探针、共同右探针的体积比为 0.6：1.0：1.6。优选地，所述杂交的温度是72℃。优选地，所述qPCR扩增的循环次数是28次。优选地，步骤6)中，通过观测样品熔解曲线峰和Tm值进行鉴定，若样品出现单一熔解曲线峰并且Tm值为78.98℃
±
0.1℃，则为麦冬；若样品出现单一熔解曲线峰且Tm值为80.57℃
±
0.1℃，则为山麦冬；若样品出现双熔解曲线峰并且熔解峰Tm值为78.98℃
±
0. 1℃和80.57℃
±
0.1℃，则为麦冬与山麦冬混合样品。本专利技术的有益效果是：本专利技术能够在很短的时间内同时鉴别中药材麦冬和山麦冬，该方法具有特异性强，灵敏度高等优点，在中药材真伪鉴定领域有很好的应用前景。
附图说明
图1是MLPA反应杂交温度的筛选。图2是MLPA反应循环数的筛选。图3是MLPA反应混合探针组筛选情况。图4是麦冬、山麦冬MLPA特异性结果。分别是单一探针和混合探针与麦冬、山麦冬叶绿体基因片段杂交后的熔解曲线实验图谱。
图5是采用混合探针对麦冬单个样品灵敏度实验的熔解曲线实验图谱。图6是采用混合探针对山麦冬单个样品灵敏度实验的熔解曲线实验图谱。图7是采用混合探针对麦冬、山麦冬混合样品DNA进行杂交后的熔解曲线实验图谱。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本专利技术的技术方案进行详细说明。实施例1麦冬和山麦冬模板制备1麦冬、山麦冬基因组DNA提取采用天根植物基因组DNA提取试剂盒提取麦冬、山麦冬基因组DNA1)取药材粉末30mg，加入1ml核分离缓冲液充分混匀，在冷冻高速离心机中12, 000rpm离心5min，弃上清液，重复该步骤2次；2)将经核分离缓冲液处理后的样品中加入700μL缓冲液GP1，65℃水浴2h，水浴过程中颠倒离心管数次混合样品；3)在样品充分水浴后，向样品组织裂解的混合液中加入700μL氯仿，完全混匀，在冷冻高速离心机中12,000rpm离心5min，将离心得到的上清液转移到一个新的离心管里；4)上清液中加入700μL缓冲液GP2，颠倒混匀，充分混匀后转移至吸附柱中，在冷冻高速离心机中12,000rpm离心30s，弃废液；5)向吸附柱中加入500μL缓冲液GD，在冷冻高速离心机中12,000rpm离心30s，弃废液；6)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，在冷冻高速离心机中12,000rpm离心30s，弃废液，并重复该步骤一次；7)将吸附柱再次放回收集管中，在冷冻高速离心机中12,000rpm离心2min，将吸附柱转移到新的离心管，彻底晾干吸附柱中的漂洗液；8)向吸附柱膜的正中位置悬空滴加洗脱缓冲液TE 50μL，在室温条件下放置5min 使洗脱缓冲液TE充分浸润吸附柱膜，在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于多重连接探针扩增技术对中药材麦冬与山麦冬进行鉴别的方法，其特征在于包括以下步骤：1)提取样品基因组DNA；2)以提取的基因组DNA为模板，利用特异性引物扩增麦冬与山麦冬的叶绿体基因片段并纯化扩增产物；3)将MLPA探针与纯化产物进行杂交；4)利用DNA连接酶将步骤3)的杂交产物进行连接；5)利用通用引物对步骤4)的连接产物进行qPCR扩增；6)收集熔解曲线信号，观测Tm值，其中，所述MLPA探针共3条，由两条左探针和一条右探针组成，探针序列如下：麦冬左探针：如SEQ ID NO:1所示的序列；山麦冬左探针：如SEQ ID NO:2所示的序列；共同右探针：如SEQ ID NO:3所示的序列。2.如权利要求1所述对中药材麦冬与山麦冬进行鉴别的方法，其特征在于，所述麦冬与山麦冬的叶绿体基因片段的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:8、9所示。3.如权利要求2所述对中药材麦冬与山麦冬进行鉴别的方法，其特征在于，用于扩增所述叶绿体基因片段的特异性引物序列如下；上游引物:如SEQ ID NO:4所示的序列；下游引物:如SEQ ID NO:5所示的序列。4.如权利要求1所述对中药材麦冬与山麦冬进行鉴别的方法，其特征在于，所述通用引物序列如下：Primer F:如SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪波，胡敏，徐玲，王文斌，李小芳，程华春，莫静，
申请(专利权)人：湖北省药品监督检验研究院，
类型：发明
国别省市：