一种利用低共熔溶剂提取香榧假种皮中黄酮类化合物的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用低共熔溶剂提取香榧假种皮中黄酮类化合物的方法，并对提取工艺作了优化；本发明专利技术利用酶解法、微波辅助法、超声辅助法和低共熔溶剂相结合的方法提取香榧假种皮中黄酮类化合物，此方法提取的黄酮类化合物与常规提取法相比含量提高了227％，该方法新颖、高效、绿色环保，避免了有机溶剂的大量使用，能够有效缓解环境污染问题，为天然产物中活性成分的提取提供了新的思路与方法。活性成分的提取提供了新的思路与方法。

【技术实现步骤摘要】
一种利用低共熔溶剂提取香榧假种皮中黄酮类化合物的方法


[0001]本专利技术属于天然产物提取
，具体涉及一种利用低共熔溶剂提取香榧假种皮中黄酮类化合物的方法。

技术介绍

[0002]香榧(Torreya grandis)，别名榧树、榧子等，为裸子植物门，红豆杉科榧树属的常绿针叶乔木，为我国特有树种、国家二级保护植物，主产于江浙等地。研究发现，榧树中化学成分的主要结构类型有黄酮类、木脂素类、二萜类、脂肪酸类、挥发油类和氨基酸类等。现代药理学研究发现其具有抗菌、驱虫、镇咳、抗病毒和抗肿瘤作用，此外香榧叶提取物被报道具有抗疲劳和抗氧化作用。
[0003]黄酮类化合物结构中常连接有酚羟基、甲氧基、甲基、异戊烯基等官能团。此外，它还常与糖结合成苷。目前已知的黄酮类化合物超过1万种，根据结构的不同可以分为黄酮、二氢黄酮、异黄酮、黄酮醇、黄烷醇和花色素六大类。黄酮类化合物是多种药用植物的主要有效成分，例如，黄芩中的黄芩苷和黄芩素为黄酮及黄酮醇类化合物，儿茶中的儿茶素为黄烷醇类化合物。在植物中黄酮大多与糖结合，以黄酮苷的形式存在，少部分以游离态存在。现代药理学研究表明黄酮类化合物具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤等多种药理活性，在药品开发和食品保健领域具有广泛的应用前景。
[0004]低共熔溶剂(DES)是近些年才快速兴起的一类优良绿色溶剂。与传统有机溶剂相比，低共熔溶剂具有价格低廉、配制简单、化学性质稳定、易于储存、无毒性及可生物降解等优点，是一种理想的传统有机溶剂替代溶剂和天然产物绿色提取溶剂。低共熔溶剂在天然产物提取方面有着广泛应用，已有研究人员报道用来提取黄酮类、酚类、多糖、蛋白质、花青素和生物碱等物质。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的是提供一种利用低共熔溶剂提取香榧假种皮中黄酮类化合物的方法。
[0006]本专利技术的技术方案如下：
[0007]一种利用低共熔溶剂提取香榧假种皮中黄酮类化合物的方法，包括以下步骤：
[0008](1)预处理
[0009]将新鲜的香榧假种皮烘干，粉碎后获得干燥的香榧假种皮粉末，备用；
[0010](2)酶解
[0011]取步骤(1)准备好的香榧假种皮粉末，加入酶液，在25～35℃下酶解2～4h，得到酶解产物；
[0012]所述酶液为纤维素酶液和果胶酶液的混合物；
[0013](3)微波处理
[0014]对步骤(2)所得酶解产物进行微波处理；
[0015]所述微波处理的功率为700～900W，处理时间为80～100s；
[0016](4)提取
[0017]在经过步骤(3)微波处理的体系中加入低共熔溶剂，超声(240W)辅助提取1～3h，之后离心，获得的上清液即为香榧假种皮黄酮提取液；
[0018]所述低共熔溶剂由氯化胆碱和三乙二醇合成。
[0019]进一步，步骤(2)中，所述纤维素酶液和果胶酶液均为2000u/mL，纤维素酶液在总酶液中的体积占比为60～70％，优选64％；所述纤维素酶液由纤维素酶溶于pH＝5的磷酸盐缓冲液中得到；所述果胶酶液由果胶酶溶于pH＝5的磷酸盐缓冲液中得到。
[0020]进一步，步骤(4)中，所述低共熔溶剂的合成方法为：将氯化胆碱、三乙二醇和水混合，在60～70℃下搅拌至均一稳定的液体，即得；所述氯化胆碱与三乙二醇的摩尔比为1:1～6，优选1:5.5；所得低共熔溶剂中含水量在0～60％，优选含水量为0。
[0021]进一步，本专利技术提取方法中，香榧假种皮粉末与低共熔溶剂提取料液比为1:20～100g/mL，优选1:75g/mL。
[0022]本专利技术可使用亚硝酸钠
‑
硝酸铝比色法测定香榧假种皮提取液中的黄酮含量，具体步骤为：
[0023]步骤一，称取5.0mg芦丁粉末溶于30％乙醇溶液中，至50mL容量瓶定容，即得到芦丁准溶液，于室温下保存待用；
[0024]步骤二，配制5％亚硝酸钠溶液：称取1.25g亚硝酸钠溶于去离子水中，定容至25mL；配制10％硝酸铝溶液：称取4.40g Al(NO3)3·
9H2O溶于去离子水中，定容至25mL；配制1mol/L氢氧化钠溶液：称取2.00g氢氧化钠溶于去离子水中，定容至50mL，上述溶液于室温下保存待用；
[0025]步骤三，取0mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL上述芦丁标准溶液于试管中，加入0.3mL亚硝酸钠溶液，混匀静置5min，加入0.3mL硝酸铝溶液，混匀静置6min，加入2mL氢氧化钠溶液并加30％乙醇溶液至总体积10mL，混匀静置15min，在500nm波长下测定吸光度；
[0026]步骤四，以芦丁浓度为横坐标，500nm波长下吸光度为纵坐标，制作芦丁浓度标准曲线，得到线性方程：y＝6.0951x+0.0009，R2＝0.9996；
[0027]步骤五，将步骤4中所得到的黄酮提取液代替芦丁标准溶液，按步骤5.3的步骤测定稀释的所述黄酮提取液于500nm波长下的吸光度值；
[0028]步骤六，根据步骤5.4得到的所述芦丁标准曲线回归方程，计算香榧假种皮提取液中黄酮含量，公式如下：黄酮含量(mg/g)＝[(y
‑
0.009)
×
V
×
n]/(6.0951
×
m)，其中，y为500nm波长下的吸光度值，V为香榧假种皮提取液体积(mL)，n为香榧假种皮提取液稀释倍数；0.002为所述线性回归方程的截距，0.0024为该方程的斜率，m为香榧假种皮粉末干重(g)。
[0029]一种利用低共熔溶剂提取香榧假种皮中黄酮类化合物的工艺优化方法，包括以下步骤：
[0030](1)筛选出5个影响香榧假种皮黄酮提取率的因素：提取溶剂的种类、低共熔溶剂中氢键供体和氢键受体的摩尔比、低共熔溶剂的含水量、总酶液中纤维素酶液的占比、提取料液比；
[0031](2)以香榧假种皮提取液中黄酮含量为指标，根据步骤(1)筛选出的5个因素进行
单因素实验；
[0032](3)根据步骤(2)的单因素实验结果，选取对香榧假种皮提取液中黄酮含量影响较为显著的三个因素：低共熔溶剂氯化胆碱与氢键供体的摩尔比(A)、提取料液比(B)、总酶液中纤维素酶液的占比(C)为自变量，以香榧假种皮提取液中黄酮含量为响应值，采用Box
‑
Behnken设计
‑
响应面法设计三因素三水平的响应面分析试验；
[0033]应用统计学软件Design
‑
Expert 12.0对上述响应面试验设计数据进行回归拟合分析，得到香榧假种皮提取液黄酮含量(Y)的二次多项回归方程预测模型Y＝19+0.7127A+1.66B
‑
0.0533C
‑
0.1558AB+0.6601AC
‑
0.2214BC
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用低共熔溶剂提取香榧假种皮中黄酮类化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)预处理将新鲜的香榧假种皮烘干，粉碎后获得干燥的香榧假种皮粉末，备用；(2)酶解取步骤(1)准备好的香榧假种皮粉末，加入酶液，在25～35℃下酶解2～4h，得到酶解产物；所述酶液为纤维素酶液和果胶酶液的混合物；(3)微波处理对步骤(2)所得酶解产物进行微波处理；所述微波处理的功率为700～900W，处理时间为80～100s；(4)提取在经过步骤(3)微波处理的体系中加入低共熔溶剂，超声辅助提取1～3h，之后离心，获得的上清液即为香榧假种皮黄酮提取液；所述低共熔溶剂由氯化胆碱和三乙二醇合成。2.如权利要求1所述的利用低共熔溶剂提取香榧假种皮中黄酮类化合物的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述纤维素酶液和果胶酶液均为2000u/mL，纤维素酶液在总酶液中的体积占比为60～70％；所述纤维素酶液由纤维素酶溶于pH＝5的磷酸盐缓冲液中得到；所述果胶酶液由果胶酶溶于pH＝5的磷酸盐缓冲液中得到。3.如权利要求2所述的利用低共熔溶剂提取香榧假种皮中黄酮类化合物的方法，其特征在于，所述纤维素酶液在总酶液中的体积占比为64％。4.如权利要求1所述的利用低共熔溶剂提取香榧假种皮中黄酮类化合物的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述低共熔溶剂的合成方法为：将氯化胆碱、三乙二醇和水混合，在60～70℃下搅拌至均一稳定的液体，即得。5.如权利要求4所述的利用低共熔溶剂提取香榧假种皮中黄酮类化合物的方法，其特征在于，所述氯化胆碱与三乙二醇的摩尔比为1:1～6，所得低共熔溶剂中含水量在0～60％。6.如权利要求5所述的利用低共熔溶剂提取香榧假种皮中黄酮类化合物的方法，其特征在于，所述氯化胆碱与三乙二醇的摩尔比为1:5.5，所得低共熔溶剂中含水量在0。7.如权利要求1所述的利用低共熔溶剂提取香榧假种皮中黄酮类化合物的方法，其特征在于，香榧假种皮粉末与低共熔溶剂提取料液比为1:20～100g/mL。8.如权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐晓倩，杨胜利，王逸峰，徐德，张慧，刘兴泉，王伟，胡文迪，程勇，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：