基因组内同源重组制造技术

提供了用于植物中可诱导的、高效的基因组内同源重组(IGHR)系统的组合物和方法，该IGHR系统可用于非嵌合的、可遗传的基因靶向。靶向整合的IGHR方法的优势在于每个细胞都含有供体DNA和核酸酶编码序列，因此在植物发育过程中可能会发生许多潜在的同源定向靶向事件。中可能会发生许多潜在的同源定向靶向事件。中可能会发生许多潜在的同源定向靶向事件。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基因组内同源重组
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2020年2月24日提交的美国临时申请号62/980，769的权益，该临时申请通过援引以其全文并入本文。


[0003]本公开涉及分子生物学领域，特别是涉及指导多核苷酸/内切核酸酶系统的组合物以及用于修饰细胞基因组的组合物和方法。

技术介绍

[0004]CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)
‑
Cas91已成为一种强大且多功能的基因组编辑工具，可用于创建靶向双链断裂(DSB)。这种方法克服了传统育种产生的随机DSB的局限性，并加速了改良和潜在新作物的开发。自然细胞DSB修复机制依赖于非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)。NHEJ是一种容易出错的修复途径，涉及非同源序列或具有微同源性的序列的连接，通常导致DSB位点处的小插入或缺失(插入缺失(indel))。另一方面，HR需要修复模板，该模板的序列与DSB侧翼的序列同源，从而实现DSB位点的精确修复。NHEJ是体细胞中主要的DNA修复途径，而据观察HR的频率要低得多。虽然靶向DSB可以使供体修复模板访问所希望的基因组位点，但DSB并不能阻止供体序列在基因组其他地方的异位整合。
[0005]基因靶向(GT)依赖于内源性同源重组机制，该机制用于修复由于DSB或减数分裂期间同源物
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之间的交叉导致的基因组DNA损伤。双链断裂会刺激细胞的DNA修复机制，使断裂位点可供供体模板使用，从而实现潜在的GT。由于设计的灵活性和易用性，CRISPR/Cas9已成为为基因组工程应用创建靶向DSB的重要生物技术工具。在体细胞中，主要涉及不相关序列或具有微同源性的序列的连接的NHEJ是主要的DNA修复途径。虽然使用CRISPR/Cas的靶向诱变现在在适合转化的植物中成为常规，但HR介导的靶向插入或等位基因替换仍然是一个挑战。GT频率低的问题因以下原因而进一步加剧：普遍依赖于使用选择性标志物来富集回收的植物群体中的GT，以及因此带来的对开发无选择标志物的GT系统的需求，这对于下游应用和产品部署来说是需要的。供体模板的随机整合加之转化和再生方面的局限性，使得植物中的GT效率极低。GT的产生时间长和效率低一直是该方法在植物中常规应用的两大瓶颈。低频GT加上对多代的广泛选择和/或筛选，使这些方法对于在作物植物中常规应用变得不切实际。
[0006]CRISPR
‑
Cas9是一种强大的工具，可用于创建靶向诱变和所希望的基因组缺失。然而，在可以完全实现CRISPR
‑
Cas技术的应用之前，精确的基因插入或序列替换仍然是一个障碍。

技术实现思路

[0007]提供了用于例如植物中的高效基因靶向的基因组内同源重组(IGHR)的方法和组
合物。IGHR可以在细胞的减数分裂阶段实现，在此阶段期间同源重组可能比非同源末端连接双链断裂修复更受青睐。将侧翼为与靶位点具有同源性的区域的供体DNA分子插入基因组中的非靶位点，然后使用RNA指导的Cas内切核酸酶将其切除，以在靶位点进行同源重组。
[0008]附图和序列表的说明
[0009]根据下列的详细描述和附图以及序列表，可以更全面地理解本公开，下列详细描述和附图以及序列表形成本申请的一部分。
[0010]图1描述了用于在玉蜀黍中进行HDR介导的无选择精确插入的诱导型Cas9和选择标志物激活系统，包括：T
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DNA构建体的示意图，该T
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DNA构建体含有由诱导型启动子(IndP)驱动的Cas9、由U6启动子表达的指导RNA、侧翼为同源臂(HR1和HR2)和插入到选择性标志物(SM)与上游启动子之间使得选择性标志物在该构型中不起作用的Cas9切割位点(由剪刀形指示)的供体；T
‑
DNA构建体随机稳定整合到植物基因组中；在供体和靶切割位点处进行Cas9诱导和同时发生的双链断裂(DSB)后，将释放供体DNA修复模板，该模板将用于使用HR来修复切割位点处的断裂；HR介导的靶位点处修复将促使供体的靶向插入，供体基因座处的DSB将由NHEJ修复，从而产生功能选择性标志物。
[0011]图2是用于测试供体DNA修复模板释放的Cas9热激诱导处理的工作流程。HS＝热激处理(在45℃、70％相对湿度下进行3小时的热激处理)；D＝天；IE＝未成熟胚。
[0012]图3是包含供体模板的不同构建体的示意性描述。构建体HSP26
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Cas9
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Gen1包含热激诱导型启动子26(HSP26)驱动的Cas9、表达指导RNA的玉蜀黍U6启动子。供体模板包含功能性ZMUbi
‑
nptII基因盒，该基因盒侧翼是同源臂(411bp HR1和HR2)和插入到选择性标志物HRA与上游高粱ALS启动子之间的Cas9切割位点(如剪刀形所示)。该构建体还包含第一代(Gen1)形态发生基因包(在实例中描述)。构建体HSP17.7
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Cas9
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Gen1含有Cas9驱动的热激诱导型启动子17.7(HSP17.7)，其余的构建体设计类似于构建体HSP26
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Cas9
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Gen1。HSP26
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Cas9
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Gen2构建体在设计上类似于SP26
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Cas9
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Gen1，其中HSP26
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Cas9
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Gen2构建体具有第二代(Gen2)形态发生基因包(在实例中描述)。
[0013]图4A是使用驱动Cas9的不同热诱导型启动子释放供体模板的示意图，具有用于在没有或有供体模板释放的情况下扩增PCR产物的PCR引物(如箭头所示)的构建体设计示意图。图4B示出了在一次或两次热激处理后获得的阳性缺失PCR产物。
[0014]图5示出了检测基因靶向的分子分析。线(1)示出了供体靶向插入后的基因组靶位点。线(2)示出了用于T0植物的GT检测的诊断性PCR引物和来自5
’
和3
’
PCR的预期产物。线(3)和(4)示出了用于T1植物的GT确认的PCR引物和来自5
’
和3
’
长PCR的预期产物。
[0015]图6A示出了大豆基因组内HDR载体和方法的一般示意图，其中切割位点位于供体模板的侧翼。图6B描绘了用于IGHR的大豆转化的构建体设计。图6C描绘了用于IGHR的卡诺拉油菜转化的构建体设计。
具体实施方式
[0016]提供了用于可用于高频、无选择基因靶向(GT)的基因组内同源重组(IGHR)的组合物和方法。热激诱导型Cas9用于玉蜀黍中无选择供体模板的基因组内动员。设计构建体使得从预先整合的T
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DNA中释放供体模板并且随后进行染色体DNA修复，进而激活供体基因座内的选择性标志物基因。与之前需要多代和广泛筛选的植物内或基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于在细胞内靶位点处进行基因组内同源重组的方法，所述方法包括：(a)向所述细胞提供包含构建体的组合物，其中所述构建体包含：(i)侧翼为能够与所述靶位点附近的序列杂交的同源区的供体DNA，其中所述侧翼为同源区的供体DNA分子的侧翼进一步为Cas内切核酸酶切割位点序列，其中所述Cas内切核酸酶切割位点序列与所述靶位点处的序列具有同源性，其中所述供体DNA、同源区和Cas内切核酸酶切割位点存在于所述构建体中的启动子和选择性标志物编码序列之间；以及(ii)编码Cas内切核酸酶的基因，所述基因可操作地连接到诱导型启动子；其中将所述构建体整合到所述细胞的基因组中的整合位点中，所述整合位点不是所述靶位点；(b)向所述细胞提供指导RNA，其中所述指导RNA识别所述细胞中所述靶位点处或附近的序列；(c)在诱导(c)的诱导型启动子的条件下孵育所述细胞，使得(a)(ii)的编码Cas内切核酸酶的基因得以表达；(d)使(a)(ii)的Cas内切核酸酶与(b)的指导RNA形成复合物；(e)用所述Cas内切核酸酶切割所述靶位点和所述侧翼为同源区的供体DNA；(f)从所述整合位点释放所述供体DNA，从而激活所述选择性标志物的表达；(g)将所述供体DNA掺入所述靶位点中；(h)通过评估所述激活的选择性标志物的表达来验证所述整合位点中所述供体DNA的释放；以及（i)对所述供体DNA向所述靶位点的掺入进行验证；其中所述供体DNA对于所述靶位点是异源的。2.一种生产具有稳定整合供体DNA的植物的方法，所述方法包括：(a)向获得自或衍生自所述植物的细胞提供包含构建体的组合物，其中所述构建体包含：(i)侧翼为能够与所述靶位点附近的序列杂交的同源区的供体DNA，其中所述侧翼为同源区的供体DNA分子的侧翼进一步为Cas内切核酸酶切割位点序列，其中所述Cas内切核酸酶切割位点序列与所述靶位点处的序列具有同源性，其中所述供体DNA、同源区和Cas内切核酸酶切割位点存在于所述构建体中的启动子和选择性标志物编码序列之间；以及(ii)编码Cas内切核酸酶的基因，所述基因可操作地连接到诱导型启动子；其中将所述构建体整合到所述细胞的基因组中的整合位点中，所述整合位点不是所述靶位点；(b)向所述细胞提供指导RNA，其中所述指导RNA识别所述细胞中所述靶位点处或附近的序列；(c)在诱导(c)的诱导型启动子的条件下孵育所述细胞，使得(a)(ii)的编码Cas内切核酸酶的基因得以表达；(d)使(a)(ii)的Cas内切核酸酶与(b)的指导RNA形成复合物；(e)用所述Cas内切核酸酶切割所述靶位点...

【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：先锋国际良种公司，
类型：发明
国别省市：