一种重编程成纤维细胞为类卵巢颗粒细胞的方法及其应用技术

本发明专利技术属于细胞培养领域，具体涉及一种重编程成纤维细胞为类卵巢颗粒细胞的方法及其应用。通过高表达蛋白重编程成纤维细胞为类卵巢颗粒细胞（hiGC），并通过AMH报告系统和/或CD55卵巢颗粒细胞特异性标记分子，分选获得具有不同类固醇激素合成水平、对应不同卵泡发育阶段的hiGC。将为研究颗粒细胞的功能及其与卵母细胞的相互作用提供细胞模型，也将帮助我们了解和治疗颗粒细胞相关疾病，如多囊卵巢综合征及卵巢早衰，其类固醇激素分泌特性有临床应用潜能，该方法具有重要的基础及临床研究意义。义。义。

【技术实现步骤摘要】
一种重编程成纤维细胞为类卵巢颗粒细胞的方法及其应用


[0001]本专利技术属于细胞培养领域，具体涉及一种重编程成纤维细胞为类卵巢颗粒细胞的方法及其应用。

技术介绍

[0002]卵巢颗粒细胞与卵母细胞共同组成卵泡结构，在卵母细胞的发育和成熟过程中不可或缺。人类卵泡发育起始于胚胎期，卵泡的发生起始于原始卵泡，根据卵泡大小、卵母细胞和颗粒细胞的发育程度，卵泡可以大致分为原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、有腔卵泡和排卵前卵泡五个发育阶段(Li et al., 2020; Saitou and Miyauchi, 2016)。由于人类颗粒细胞的来源及数量有限，难以获得大量不同时期的颗粒细胞，目前对于人类颗粒细胞的功能及其与卵母细胞相互作用的研究还不够深入和全面。
[0003]此前有研究报道，可诱导人胚胎干细胞hESC分化成为人类颗粒细胞样细胞，然而该研究未在分化体系中通过分选获得颗粒细胞，也没有将分化得到的细胞与体内颗粒细胞进行比较。hESC的诱导分化过程中会产生多种细胞类型，因此该研究所报道的颗粒细胞分化体系异质性较高，该体系中未经分选的颗粒细胞并不能应用于体外研究。目前尚未有研究报道体外诱导获得较纯的有功能性的人类颗粒细胞。直接重编程是指直接将一种细胞类型诱导成另一种细胞类型而不经过中间多能性阶段的体外诱导方法。目前尚未有研究报道利用直接重编程方法获得小鼠或人类卵巢颗粒细胞，因此，鉴定新的转录因子组合并利用直接重编程方法体外诱导人类卵巢颗粒细胞是尚未解决的问题。
[0004]FOXL2是卵巢发育中非常关键的一个转录因子，FOXL2 在卵巢中的主要作用是通过抑制睾丸特异性的基因以维持颗粒细胞特性。在患有无角间性综合症的雌性山羊中，Foxl2表达异常导致向雄性转变的症状，以及卵巢向睾丸转分化(Pailhoux et al., 2002)。但该转录因子在重编程中的应用未见报道。
[0005]NR5A1属于NR5A孤儿核受体家族，在成体雌性中，NR5A1可调控STAR、HSD3B2、CYP11A1基因的表达，并调节卵巢颗粒细胞的孕酮合成(Lai et al., 2013)。但在重编程类卵巢颗粒细胞中的应用未见报道。

技术实现思路

[0006]为解决上述问题，本专利技术提供了一种重编程成纤维细胞为类卵巢颗粒细胞（（human induced granulosa like cells，hiG））的方法及其应用，具体的：本专利技术第一方面，提供一种类卵巢颗粒细胞，所述类卵巢颗粒细胞表达抗缪勒氏管激素（anti
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llerianhormone，AMH）和/或卵巢颗粒细胞特异性标记分子。
[0007]优选的，所述类卵巢颗粒细胞包括多个发育阶段的类卵巢颗粒细胞。
[0008]更优选的，所述类卵巢颗粒细胞包括原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、有腔卵泡和/或排卵前卵泡发育阶段的类卵巢颗粒细胞。
[0009]进一步优选的，所述类卵巢颗粒细胞包括原始卵泡、初级卵泡、有腔卵泡和/或排
卵前卵泡发育阶段的类卵巢颗粒细胞。
[0010]更优选的，相对于未重编程的成纤维细胞，所述类卵巢颗粒细胞高表达原始卵泡、初级卵泡、有腔卵泡和/或排卵前卵泡相关基因或者蛋白，进一步优选的，所述基因或者蛋白包括NR5A1、FOXL2、CYP11A1、PGR、STAR、OCA2、SPR、DCN、KDSR、TST、ZEB2、HSD3B2、PLA2G1B、FST和/或AR中的一种或者多种。例如，所述基因或者蛋白包括HSD3B2、PLA2G1B、HSD17B1、CYP11A1和/或PGR，或者，所述基因或者蛋白包括FST和/或AR等等。
[0011]优选的，所述类卵巢颗粒细胞经刺激后可分泌类固醇激素，更优选的，所述的类固醇激素包括雌激素和/或孕激素，所述的雌激素包括17β
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雌二醇；所述的孕激素包括孕酮。
[0012]更优选的，相对于未重编程的成纤维细胞或卵巢颗粒细胞，所述类卵巢颗粒细胞的17β
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雌二醇分泌增加。
[0013]优选的，所述刺激包括添加睾酮、FSH和/或Activin A对类卵巢颗粒细胞进行培养。
[0014]优选的，所述类卵巢颗粒细胞表达AMH。
[0015]更优选的，所述类卵巢颗粒细胞经刺激后分泌类固醇激素，更优选的，所述的类固醇激素包括雌激素，例如17β
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雌二醇，进一步优选的，所述类固醇激素还包括孕激素，例如孕酮。更优选的，相对于未重编程的成纤维细胞或卵巢颗粒细胞，所述类卵巢颗粒细胞的17β
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雌二醇和/或孕酮分泌增加。
[0016]优选的，所述刺激包括添加睾酮、FSH和/或Activin A对类卵巢颗粒细胞进行培养。
[0017]优选的，所述类卵巢颗粒细胞的转录组与卵丘颗粒细胞具有相似性，相对于成纤维细胞，类卵巢颗粒细胞与卵丘颗粒细胞具有共同上调或者共同下调的基因，例如共同上调可达到704个基因，或者低于704的任意值；共同下调的基因可达到964个基因，或者低于964的任意值。
[0018]更优选的，共同上调基因包括与脂质代谢、对类固醇激素的响应、类固醇激素代谢、类固醇激素合成、类固醇的代谢调控、胆固醇运输等调控类固醇激素合成及代谢的过程相关的基因。共同下调基因包括与DNA复制、细胞核分裂、染色体分离等与细胞增殖相关的生物学过程关联的基因。
[0019]进一步优选的，所述共同上调基因包括但不仅限于CYP11A1、AR、PGR、STAR、OCA2、SPR、DCN、KDSR、TST、ZEB2。
[0020]优选的，所述类卵巢颗粒细胞高表达NR5A1、FOXL2、CYP11A1、AR、PGR、STAR、OCA2、SPR、DCN、KDSR、TST、ZEB2、HSD17B1、HSD3B2和/或PLA2G1B中的一种或者多种基因和/或蛋白。
[0021]优选的，所述类卵巢颗粒细胞在RNA水平有腔卵泡或排卵前卵泡相关基因表达较高。进一步的，所述类卵巢颗粒细胞中上调的基因与细胞外基质组成、类固醇激素合成与代谢、生殖系统发育等生物学过程相关联。
[0022]优选的，所述类卵巢颗粒细胞为有腔卵泡或排卵前卵泡发育阶段的类卵巢颗粒细胞。优选的，所述类卵巢颗粒细胞表达卵巢颗粒细胞特异性标记分子。
[0023]更优选的，所述卵巢颗粒细胞特异性标记分子包括CD55、GPC4、DLK1、CD9及IGF1R中的一种或者多种。更优选的，所述特异性标记分子包括CD55。
[0024]更优选的，相对于人卵巢颗粒肿瘤细胞系COV434，所述表达卵巢颗粒细胞特异性标记分子的类卵巢颗粒细胞中17β
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雌二醇分泌增加，和/或孕酮分泌无变化，所述无变化是指统计学上无显著性差异。
[0025]更优选的，所述类卵巢颗粒细胞高表达早期颗粒细胞相关基因。进一步优选的，所述类卵巢颗粒细胞在RNA水平原始或初级卵泡相关基因表达较高。更优选的，所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种类卵巢颗粒细胞，其特征在于，所述类卵巢颗粒细胞表达抗缪勒氏管激素AMH和/或卵巢颗粒细胞特异性标记分子。2.根据权利要求1所述的类卵巢颗粒细胞，其特征在于，所述类卵巢颗粒细胞包括原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、有腔卵泡和/或排卵前卵泡发育阶段的类卵巢颗粒细胞。3.根据权利要求1所述的类卵巢颗粒细胞，其特征在于，所述类卵巢颗粒细胞高表达原始卵泡、初级卵泡、有腔卵泡和/或排卵前卵泡相关基因或者蛋白。4.根据权利要求1所述的类卵巢颗粒细胞，其特征在于，所述类卵巢颗粒细胞可分泌类固醇激素，所述的类固醇激素包括雌激素和/或孕激素。5.一种蛋白在成纤维细胞重编程为权利要求1
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4任一所述的类卵巢颗粒细胞中的应用，其特征在于，所述蛋白包括FOXL2、NR5A1、RUNX1、GATA4、WT1和/或RSPO1中的一种或者多种。6.一种权利要求1
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4任一所述的类卵巢颗粒细胞的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：1）对成纤维细胞进行基因修饰，所述基因修饰使得成纤维细胞中蛋白的活性提高或者过表达，所述蛋白包括FOXL2、NR5A1、RUNX1、GATA4、WT1和/或RSPO1中的一种或者多种；2）培养所述成纤维细胞重编程为类卵巢颗粒细胞。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤1）的基因修饰的方式包括点突变，连接强启动子，连接增强子，提高拷贝数、融合共表达或者转基因。8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述基因修饰的方式包括转基因导入外源基因，所述外源基因编码所述的蛋白。9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述基因修饰的方式包括利用转染载体转染成纤维细胞导入外源基因。10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤1）包括：A）构建含有编码所述蛋白的核苷酸序列的转染载体A；B）将步骤A）获得的转染载体A转染成纤维细胞。11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤A）包括：a）构建高表达所述蛋白的慢病毒载体：扩增所述蛋白的基因，并将其分别克隆至慢病毒载体上；b）慢病毒包装：使用宿主细胞将步骤a）获得的慢病毒载体包装为慢病毒，并收集含有目的基因的慢病毒。12.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤A）还包括步骤A0）：构建含有报告系统的转染载体A0，所述报...

【专利技术属性】
技术研发人员：文凡，纪家葵，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：