一种纳米大小羟基磷灰石颗粒的血管内皮细胞单层毒性检测方法技术

本发明专利技术属于医药技术领域，公开了一种纳米大小羟基磷灰石颗粒的血管内皮细胞单层毒性检测方法，具体公开了一种羟基磷灰石颗粒的血管内皮细胞单层毒性检测方法，包括以下步骤：(1)构建血管内皮细胞单层；(2)在步骤(1)中的血管内皮细胞单层中加入含羟基磷灰石颗粒的培养液，培养；(3)以不加含羟基磷灰石颗粒的培养液与步骤(1)中的血管内皮细胞单层共培养为对照组，仅含有培养液且不含细胞为空白组，检测细胞活性，计算细胞存活率。本发明专利技术直接将血管内皮细胞单层暴露于广泛浓度范围的羟基磷灰石颗粒中，通过检测细胞活性即可评估羟基磷灰石颗粒对血管内皮细胞单层的毒性作用，以评价羟基磷灰石颗粒对血管室的相互作用。价羟基磷灰石颗粒对血管室的相互作用。

【技术实现步骤摘要】
一种纳米大小羟基磷灰石颗粒的血管内皮细胞单层毒性检测方法


[0001]本专利技术属医药
，具体涉及一种纳米大小羟基磷灰石颗粒的血管内皮细胞单层毒性检测方法。

技术介绍

[0002]血管的稳态是由内皮细胞、血小板和凝血系统的动态相互作用来保证的。因此，颗粒材料的血管安全必须解决这一综合系统，这种方法在很大程度上被忽略了。羟基磷灰石由于其与骨骼和牙齿的无机相相似，具有多种生物医学应用。因此，它被广泛用于各种与骨修复有关的应用中，包括单独或作为复合/混合材料修复/再生、增生和涂层材料，以及最近用于牙釉质再矿化剂和牙膏的散装和颗粒制剂。无论是在骨骼或牙齿内的局部应用(在植入材料降解和扩散事件后，或在牙膏使用的口腔环境中的重复应用)，还是在那些以循环策略为目标的应用中，羟基磷灰石颗粒都出现在血管区间。在这里，在尺寸、形态和表面特性方面具有广泛特征的颗粒与复杂的细胞和生化血液环境接触并相互作用。
[0003]在血管区，内皮细胞、血小板和凝血因子的协同作用确保了血管和组织内稳态的维持。内皮是衬在血管内的单层细胞，是血液和非血管组织之间的动态界面，形成一道屏障，防止血液成分与内皮下细胞外基质接触。此外，它还通过表达和分泌血管活性分子协助维持适当的血流和防止血管内血小板活化和血液凝固，在调节血管张力方面具有关键作用。对这个连续的细胞单层的损害会暴露出内皮下组织，从而触发局部血小板的募集、粘附、激活和聚集。在这种情况下，羟基磷灰石颗粒在血管环境中的存在可能会影响这种动态内稳态，因此对羟基磷灰石颗粒的评估是对其安全性的要求。虽然已经对羟基磷灰石颗粒的生物相容性进行了分析，特别是针对骨组织，而关于其与血管室相互作用的信息却很少，而且很松散，无法确定羟基磷灰石颗粒的血管安全性。

技术实现思路

[0004]本专利技术第一方面的目的，在于提供一种羟基磷灰石颗粒的血管内皮细胞单层毒性检测方法。
[0005]本专利技术第二方面的目的，在于提供本专利技术第一方面的检测方法在羟基磷灰石颗粒生物安全性评价中的应用。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：
[0007]本专利技术分析了商用羟基磷灰石颗粒在内皮细胞行为方面的影响，因为它们与临床有关，而关于其血管生物安全性数据却很稀少。
[0008]本专利技术的第一个方面，提供一种羟基磷灰石颗粒的血管内皮细胞单层毒性检测方法，包括以下步骤：
[0009](1)构建血管内皮细胞单层；
[0010](2)在步骤(1)中的血管内皮细胞单层中加入含羟基磷灰石颗粒的培养液，培养；
[0011](3)以不加含羟基磷灰石颗粒的培养液与步骤(1)中的血管内皮细胞单层共培养为对照组，仅含有培养液且不含细胞为空白组，检测细胞活性，计算细胞存活率。
[0012]步骤(1)具体为：将细胞在48孔板内培养至细胞密度不低于80％，去除培养液，即得到血管内皮细胞单层。
[0013]优选地，所述细胞为HUVEC细胞、EAhy926细胞、HMWC
‑
1、HULEC
‑
5a中的至少一种。
[0014]优选地，步骤(2)中所述羟基磷灰石颗粒的终浓度为1～1500μg/mL。
[0015]进一步优选地，步骤(2)中所述羟基磷灰石颗粒的终浓度为1～1000μg/mL。
[0016]优选地，所述含羟基磷灰石颗粒的培养液的制备方法为：将羟基磷灰石颗粒与培养基混合，即得到含羟基磷灰石颗粒的培养液。
[0017]优选地，步骤(2)中所述培养的条件为37℃培养20～30h。
[0018]进一步优选地，步骤(2)中所述培养的条件为37℃培养20～24h。
[0019]优选地，所述羟基磷灰石颗粒为球状形态和/或棒状形态的羟基磷灰石颗粒。
[0020]优选地，所述棒状形态的羟基磷灰石颗粒的长度分布在10～100nm，宽度分布在5～50nm。
[0021]进一步优选地，所述棒状形态的羟基磷灰石颗粒的长度分布在20～90nm，宽度分布在5～30nm。
[0022]优选地，所述棒状形态的羟基磷灰石颗粒的比表面积为25～35m2/g。
[0023]进一步优选地，所述棒状形态的羟基磷灰石颗粒的比表面积为30～35m2/g。
[0024]优选地，所述球状形态的羟基磷灰石颗粒的长度分布在10～100nm，宽度分布在10～100nm。
[0025]进一步优选地，所述球状形态的羟基磷灰石颗粒的长度分布在10～90nm，宽度分布在10～90nm。
[0026]优选地，所述球状形态的羟基磷灰石颗粒的比表面积为80～90m2/g。
[0027]进一步优选地，所述球状形态的羟基磷灰石颗粒的比表面积为80～85m2/g。
[0028]优选地，所述羟基磷灰石颗粒表面含有碳(C1s)元素、氧(O1s)元素、钙(Ca2P3)元素和磷(P2p)元素。
[0029]优选地，步骤(3)采用MTT法或CCK8法检测细胞活性。
[0030]本专利技术第二方面，提供本专利技术第一方面的检测方法在羟基磷灰石颗粒生物安全性评价中的应用。
[0031]本专利技术的有益效果是：
[0032]本专利技术直接将血管内皮细胞单层暴露于广泛浓度范围的羟基磷灰石颗粒中，通过检测细胞活性即可评估羟基磷灰石颗粒对血管内皮细胞单层的毒性作用，以评价羟基磷灰石颗粒对血管室的相互作用，该方法具有操作简单、重现性好和判定方便等优点，克服了现有技术关于羟基磷灰石颗粒与血管室相互作用的信息却很少的缺点，可有效解决羟基磷灰石颗粒材料的血管安全性评价的问题。
[0033]进一步本专利技术将HUVEC细胞接种在48孔板上培养至细胞密度为80％以构建血管内皮细胞单层，该建血管内皮细胞单层可以模拟血管室真实的血管内皮单层，方便用于分析与内皮细胞的相互作用以解决生物材料的血管效应。
附图说明
[0034]图1为不同浓度的羟基磷灰石颗粒(棒状和球状)溶解在无菌生理盐水和DMEM培养基溶液中的实图。
[0035]图2为羟基磷灰石颗粒(棒状和球状)的透射电子显微镜图。
[0036]图3为羟基磷灰石颗粒(棒状和球状)的长、宽分布统计结果图。
[0037]图4为羟基磷灰石颗粒(棒状和球状)的XPS能谱图。
[0038]图5为通过浓度梯度法确定HUVEC细胞密度的表征曲线。
[0039]图6为不同浓度的HUVEC细胞铺板2天后的光镜照片。
[0040]图7为不同浓度羟基磷灰石颗粒(棒状和球状)与HUVEC单层直接接触培养(暴露)24h的细胞存活率的结果统计图。
具体实施方式
[0041]以下通过具体的实施例对本专利技术的内容作进一步详细的说明。
[0042]应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。
[0043]本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。
[0044]实施例1
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种羟基磷灰石颗粒的血管内皮细胞单层毒性检测方法，包括以下步骤：(1)构建血管内皮细胞单层；(2)在步骤(1)中的血管内皮细胞单层中加入含羟基磷灰石颗粒的培养液，培养；(3)以不加含羟基磷灰石颗粒的培养液与步骤(1)中的血管内皮细胞单层共培养为对照组，仅含有培养液且不含细胞为空白组，检测细胞活性，计算细胞存活率。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述羟基磷灰石颗粒的终浓度为1～1500μg/mL。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)具体为：将细胞在48孔板内培养至细胞密度不低于80％，去除培养液，即得到血管内皮细胞单层。4.根据权利要求1～3中任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述培养的条件为37℃培养20～30h；优选地，步骤(3)采用MTT法或CCK8法检测细胞活性。5.根据权利要求1～3中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述羟基磷灰石颗粒为球状...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛玉清，孙玮棠，贾炜，胡金华，孙秀红，付铭，赵彰，
申请(专利权)人：广州市妇女儿童医疗中心，
类型：发明
国别省市：